【摘要】：棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物,黃萎病嚴(yán)重危害棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì),尋找抗黃萎病基因,明確基因功能,深入解析棉花抗黃萎病的分子機(jī)制是棉花抗病育種中亟需解決的重要科學(xué)問題。高質(zhì)量版本的基因組是提升基因家族分析準(zhǔn)確性的必要條件。本研究以目前最新的陸地棉TM-1高質(zhì)量版本基因組為參考,通過生物信息學(xué)分析鑒定了陸地棉基因組中的Laccase(LAC)基因家族,并對其進(jìn)行了理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位以及在黃萎病脅迫下的表達(dá)模式分析。結(jié)合抗病轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和全長cDNA文庫篩選以及功能尚未報(bào)道的前提,挑選出4個(gè)與擬南芥直系同源的新基因,分別命名為GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12。為明確候選基因抗黃萎病功能及分子機(jī)制,本研究進(jìn)一步從基因表達(dá)、VIGS基因功能方面研究了四個(gè)候選基因的功能。主要研究結(jié)果如下:1.陸地棉TM-1基因組鑒定到83個(gè)LAC家族成員,分布在24條染色體上,所有LAC蛋白均定位在胞外,且具有相同/相似的保守基序。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示LAC基因家族成員可分為7個(gè)亞組。生物信息學(xué)分析GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12分別編碼558、564、563、510個(gè)氨基酸殘基蛋白,GhLAC4,GhLAC7和GhLAC11分別含有一個(gè)信號肽,GhLAC12沒有信號肽,GhLAC11具有一個(gè)跨膜域,其他三個(gè)基因無跨膜域。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,四個(gè)漆酶基因編碼蛋白都定位在細(xì)胞外。2.基于黃萎病脅迫下抗病陸地棉農(nóng)大601的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),將LAC基因家族各成員的表達(dá)分為3種模式,第1類基因呈現(xiàn)出病原菌誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào),包括GhLAC79、GhLAC80、GhLAC43等24個(gè)成員;第2類基因受病原菌脅迫后呈現(xiàn)不同程度下調(diào)表達(dá),包括GhLAC07、GhLAC40、GhLAC45、GhLAC72等56個(gè)成員,接菌后這些基因的表達(dá)明顯受到抑制,暗示這些基因在棉花抗黃萎病反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用;第3類基因不響應(yīng)黃萎病菌處理,推測其不參與棉花抗黃萎病過程,包括GhLAC11、GhLAC27和GhLAC49。3.進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定了4個(gè)漆酶基因受黃萎病菌誘導(dǎo)后的表達(dá),發(fā)現(xiàn)GhLAC4,GhLAC11和GhLAC12受黃萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào),與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)趨勢一致,GhLAC7受黃萎病菌抑制表達(dá)。組織特異表達(dá)結(jié)果顯示4個(gè)基因在根、莖、葉中均表達(dá);GhLAC4在莖中表達(dá)量最高,在根中表達(dá)量次之;GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12在根中表達(dá)量最高,莖中次之,葉中表達(dá)量均最低。4.啟動(dòng)子元件分析表明GhLAC4基因含有響應(yīng)茉莉酸甲酯(JA)和水楊酸(SA)的順式作用元件,GhLAC11含有響應(yīng)SA的順式作用元件;棉苗葉面噴施SA或JA,基因表達(dá)結(jié)果表明GhLAC4響應(yīng)SA和JA信號;GhLAC11僅響應(yīng)SA信號誘導(dǎo)。5.從抗病農(nóng)大601中克隆GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12目的片段,長度為340 bp左右,構(gòu)建VIGS載體。接黃萎病菌25d后,四個(gè)基因的沉默棉株病指低于對照,抗病性增強(qiáng),沉默棉株的H_2O_(2,)SOD和NO含量高于對照;沉默棉株的POD活力低于對照。6.接菌25d的沉默棉株和對照棉株的木質(zhì)素原位染色與測定結(jié)果顯示,沉默棉株木質(zhì)素染色均變淺,說明漆酶基因沉默后木質(zhì)素積累降低;溴乙酰法進(jìn)一步測定木質(zhì)素含量表明,沉默棉株GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12木質(zhì)素百分含量分別為15.34%、7.58%、14.78%、23.22%,對照棉株木質(zhì)素百分含量為33.31%。7.利用qRT-PCR分析沉默植株苯丙烷途徑木質(zhì)素合成途徑及其旁支黃酮類化合物和棉酚合成路徑基因的轉(zhuǎn)錄變化,發(fā)現(xiàn)沉默植株木質(zhì)素合成途徑基因PAL,4CL,COMT,HCT,CCoAOMT和CAD的表達(dá)水平均高于對照,表明較低的木質(zhì)素含量對木質(zhì)素途徑合成酶基因的轉(zhuǎn)錄水平呈負(fù)反饋;黃酮類化合物和棉酚合成相關(guān)基因CHS,CHI,DFR,F3H,F3'H,LAR,ANR和TBS表達(dá)水平高于對照。綜上,本研究鑒定了陸地棉83個(gè)GhLAC成員,明確了黃萎病菌誘導(dǎo)下各成員的表達(dá)規(guī)律;明確了GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12四個(gè)基因的功能;初步探明了四個(gè)成員的抗黃萎病機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S435.621.2
【圖文】：

棉和擬南芥 LACs 基因家族進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenic tree of LACs family members in Arabidopsis and G. hirsutum L..1.3 陸地棉漆酶基因家族的結(jié)構(gòu)和保守基序分析對陸地棉 LAC 基因家族 83 個(gè)成員的基因結(jié)構(gòu)和保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果如圖示，所有 LAC 基因的外顯子個(gè)數(shù)在 4-7 個(gè)之間變化，且基本都含有相同的保守 (Motif 1, Motif 2, Motif 3, Motif4, Motif5, Motif 9 和 Motif 10; 圖 4)。經(jīng) Pfam 數(shù)驗(yàn)證，Motif 1 和 Motif 9 完全對應(yīng)于 Cu_oxidase_3 結(jié)構(gòu)域；Motif 3 與 Cu-oxid構(gòu)域相對應(yīng)；Motif2 和 Motif4 則構(gòu)成了 Cu_oxidase_2 結(jié)構(gòu)域。某些保守基序只于某一亞組中，如 Motif 8 只存在于第 7 亞組中，這表明不同組的漆酶成員在進(jìn)功能上存在差異。

27圖 3 陸地棉 LAC 家族成員基因結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Gene structure analysis of LAC family members in G. hirsutum L.

圖 4 陸地棉 LAC 基因家族保守基序Fig.4 Conservative motifs of LAC gene family in G. hirsutum L.棉漆酶基因家族在黃萎病脅迫下的表達(dá)分析題組前期以抗病品種農(nóng)大 601 為實(shí)驗(yàn)材料，獲得了黃萎病脅迫下根的不同處理時(shí)間點(diǎn)下的 RPKM 值進(jìn)行 log2(1+RPKM) 處理后，構(gòu)建 L的表達(dá)熱圖。結(jié)果顯示，在 83 個(gè)陸地棉 LAC 基因中，有 80 個(gè)基因病脅迫下都發(fā)生了明顯的變化，其余 3 個(gè)基因(GhLAC11、GhL9)在接菌前后表達(dá)量未發(fā)生明顯變化，推測它們不參與棉花抵抗黃萎基因家族各成員的表達(dá)分為 3 種模式，第 1 類基因呈現(xiàn)出病原菌誘導(dǎo)括 GhLAC79、GhLAC80、GhLAC43 等 24 個(gè)成員。根據(jù)該類基因?qū)?yīng)速度和程度，進(jìn)步劃分為 3 個(gè)亞組：快速上調(diào)表達(dá)基因（I）9、GhLAC80、GhLAC06、GhLAC02、GhLAC30，這些成員在接菌后 高峰；較快上調(diào)表達(dá)基因（II），包括 GhLAC20、GhLAC77、GhLAC，該亞組基因在接菌后 6 h 達(dá)到表達(dá)高峰；第 III 亞組包括 GhL8、GhLAC58 等 10 個(gè)成員，受黃萎病菌誘導(dǎo)后這些基因在 12~24 h 之。第 2 類基因受病原菌脅迫后呈現(xiàn)不同程度下調(diào)表達(dá)，包括 GhL

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本文編號：2806736