【摘要】：微孢子蟲(Microsporidia)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核微生物,廣泛存在于自然界中,能夠感染包括人在內(nèi)的各種脊椎動物和昆蟲等無脊椎動物。家蠶微粒子(Nosema bombycis)是第一個被人類認(rèn)識的微孢子蟲,能夠感染家蠶并引起家蠶微粒子病(Pébrine),造成重大經(jīng)濟(jì)損失,并且嚴(yán)重威脅各國養(yǎng)蠶業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此,對家蠶微粒子侵染和增殖等過程的分子機(jī)制進(jìn)行深入細(xì)致的研究,不僅具有重要的理論價值,也將為家蠶微粒子病等微孢子蟲病的防治奠定基礎(chǔ)。對專性細(xì)胞內(nèi)寄生的微孢子蟲而言,分泌型蛋白的作用極其重要,其中微孢子蟲孢壁的形成、對宿主生理代謝的調(diào)控以及對宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)的抵御等生物學(xué)過程都需要依靠分泌型蛋白來完成。因此,針對微孢子蟲分泌型蛋白的鑒定,對解析微孢子蟲的增殖機(jī)制和后續(xù)防控研究都具有非常重要的意義。由于微孢子蟲無法利用現(xiàn)有技術(shù)手段進(jìn)行基因編輯,近年來,對家蠶微粒子的研究主要集中于其侵染裝置功能的解析,而針對微孢子蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖過程中起作用的分泌型蛋白研究卻鮮見報道。鑒于此,本研究通過微孢子蟲數(shù)據(jù)庫(MicrosporidiaDB)和家蠶病原微生物數(shù)據(jù)庫(SilkPathDB)對家蠶微粒子的分泌蛋白進(jìn)行了全基因組的預(yù)測分析,并篩選到了家蠶微粒子己糖激酶NbHXK(Nosema bombycis hexokinase)。NbHXK作為糖酵解途徑的代謝酶卻具有分泌信號肽序列,我們推測這很可能與家蠶微粒子專性細(xì)胞內(nèi)寄生并高度依賴宿主細(xì)胞物質(zhì)能量供應(yīng)的增殖方式有關(guān)。為了深入探究家蠶微粒子己糖激酶NbHXK的功能,我們進(jìn)行了如下研究,并得到了以下研究結(jié)果:1.家蠶微粒子能夠分泌己糖激酶NbHXK家蠶微粒子己糖激酶NbHXK基因全長1287bp,編碼一個含有428個氨基酸殘基的蛋白。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),NbHXK基因第1~25位氨基酸為預(yù)測的信號肽序列,該基因還含有兩個保守的己糖激酶結(jié)構(gòu)域(Hexokinase domain),分別位于第29~228位氨基酸和235~424位氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)NbHXK歸類于微孢子蟲屬己糖激酶,且與兩種蜜蜂微孢子蟲的親緣關(guān)系較近。將NbHXK基因的信號肽基因序列克隆到酵母信號肽誘捕載體pSUC2T7M13ORI上,再轉(zhuǎn)化到蔗糖酶缺失型酵母YTK12中,與陽性對照和陰性對照進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)NbHXK的信號肽序列能夠誘導(dǎo)目的蛋白蔗糖酶分泌到酵母細(xì)胞外,促進(jìn)轉(zhuǎn)化酵母在YPRAA培養(yǎng)基上的生長。同時克隆的蝗蟲微孢子蟲己糖激酶AlHXK基因的信號肽序列和線蟲微孢子蟲己糖激酶NaHXK基因信號肽序列都能達(dá)到相同的分泌效果,表明微孢子蟲屬可能普遍進(jìn)化出了具有信號肽序列的己糖激酶基因,且與其細(xì)胞內(nèi)寄生的生活方式密切相關(guān)。2.家蠶微粒子侵染能夠上調(diào)宿主BmHXK和BmGLUT的表達(dá)在對大造品系的5齡起蠶添食涂布了家蠶微粒子(1×10~6粒/頭)的桑葉后,不同時間點取添食家蠶微粒子組和添食清水組的家蠶中腸組織,提取mRNA反轉(zhuǎn)后進(jìn)行定量研究。在感染家蠶微粒子的家蠶中腸組織中,通過家蠶微粒子的NbSSU基因進(jìn)行定量發(fā)現(xiàn),家蠶微粒子的拷貝數(shù)在感染24h后開始呈現(xiàn)指數(shù)級增長;而對家蠶微粒子NbHXK的定量發(fā)現(xiàn)在侵染后6-12h和48-72h有兩個明顯的上調(diào)峰,很可能與微孢子蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖周期相關(guān)。通過對比家蠶微粒子感染前后的家蠶中腸組織發(fā)現(xiàn),家蠶BmHXK和BmGLUT的表達(dá)量都受到了顯著上調(diào),其中BmHXK的表達(dá)量在感染后48h上調(diào)了25倍左右,而BmGLUT的表達(dá)量在感染后18h上調(diào)了8倍左右。在細(xì)胞水平對兩種家蠶細(xì)胞BmN-SWU1和BmE進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn),家蠶微粒子的侵染能夠引起B(yǎng)mHXK的表達(dá)量的上調(diào)。以上研究結(jié)果表明,家蠶微粒子在增殖過程中能夠上調(diào)宿主細(xì)胞BmHXK和BmGLUT的表達(dá)量。3.NbHXK和BmHXK都能夠促進(jìn)家蠶微粒子的增殖亞細(xì)胞定位鑒定發(fā)現(xiàn),BmHXK核質(zhì)都有分布,主要定位在細(xì)胞質(zhì)中且在細(xì)胞膜周圍聚集,NbHXK只定位在宿主細(xì)胞質(zhì)且均勻分布。在家蠶細(xì)胞中共轉(zhuǎn)NbHXK和BmHXK后,經(jīng)PBS饑餓處理6h,發(fā)現(xiàn)BmHXK的定位發(fā)生了變化,細(xì)胞質(zhì)定位減少,而細(xì)胞核定位顯著增加,而NbHXK不能響應(yīng)饑餓處理,始終均勻分布在家蠶細(xì)胞質(zhì)中。通過在家蠶細(xì)胞中過表達(dá)NbHXK和BmHXK、敲除BmHXK、敲除BmHXK后回復(fù)NbHXK,再侵染家蠶微粒子并檢測其增殖情況,發(fā)現(xiàn)NbHXK和BmHXK都能夠促進(jìn)家蠶微粒子的增殖。通過己糖激酶抑制劑2-DG處理侵染了家蠶微粒子的家蠶細(xì)胞,也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果,己糖激酶抑制劑能夠抑制家蠶微粒子的增殖。以上研究表明NbHXK和BmHXK具有不同的亞細(xì)胞定位特征,且都能促進(jìn)家蠶微粒子的增殖。4.NbHXK和BmHXK分別與BmVDAC具有相互作用對人類己糖激酶的研究發(fā)現(xiàn),己糖激酶II(Hexokinase-II)能夠與電壓依賴性陰離子通道蛋白VDAC(voltage-dependant anion channel)相互作用,便于快速獲取能量分子ATP進(jìn)行葡萄糖到葡萄糖-6-磷酸的催化作用。因此,我們克隆了家蠶的電壓依賴性陰離子通道蛋白基因BmVDAC(Bombyx mori voltage-dependant anion channel),構(gòu)建了帶有HA標(biāo)簽的基因表達(dá)載體,通過免疫共沉淀、雙分子熒光互補(bǔ)和熒光共定位實驗分別驗證BmHXK和NbHXK是否與BmVDAC具有相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶的己糖激酶BmHXK能夠與BmVDAC相互作用,這與其他物種中的研究結(jié)果相一致。同時發(fā)現(xiàn)家蠶微粒子的己糖激酶NbHXK也能夠和宿主的BmVDAC相互作用。與BmVDAC互作,可能是分泌型己糖激酶NbHXK在宿主細(xì)胞中行使功能的分子基礎(chǔ)。5.NbHXK和BmHXK能夠增強(qiáng)宿主細(xì)胞代謝并抑制宿主細(xì)胞凋亡本研究進(jìn)一步探索了病原和宿主的兩種己糖激酶NbHXK和BmHXK在家蠶細(xì)胞代謝與凋亡中的功能。細(xì)胞培養(yǎng)液葡萄糖含量測定表明,NbHXK和BmHXK能夠促進(jìn)家蠶細(xì)胞對葡萄糖的吸收;細(xì)胞內(nèi)ATP含量檢測表明,NbHXK和BmHXK能夠增加細(xì)胞內(nèi)的ATP含量;MTS檢測細(xì)胞增殖實驗表明,過表達(dá)NbHXK和BmHXK能夠促進(jìn)家蠶細(xì)胞增殖;活性氧檢測表明,NbHXK和BmHXK都能夠降低家蠶細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平;過氧化氫誘導(dǎo)凋亡后過流式分析發(fā)現(xiàn),BmHXK能夠降低家蠶細(xì)胞的凋亡率,而敲除BmHXK顯著增加了家蠶細(xì)胞凋亡率;同樣是過氧化氫誘導(dǎo)凋亡后分別檢測Caspase 3/7和Caspase 9的活性,發(fā)現(xiàn)NbHXK和BmHXK的過表達(dá)能夠在一定程度上抑制宿主細(xì)胞的凋亡。上述研究內(nèi)容表明NbHXK和BmHXK一方面能夠能增強(qiáng)宿主細(xì)胞的物質(zhì)能量代謝,另一方面可能通過與BmVDAC的相互作用抑制了宿主細(xì)胞的凋亡,兩種方式共同作用從而有利于家蠶微粒子的增殖。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)家蠶微粒子能夠通過分泌己糖激酶NbHXK進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì),并且通過上調(diào)宿主細(xì)胞的己糖激酶BmHXK和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白BmGLUT的表達(dá)量來增強(qiáng)宿主細(xì)胞的糖酵解作用以產(chǎn)生更多ATP和中間代謝產(chǎn)物,同時通過兩種己糖激酶與BmVDAC的相互作用在一定程度上抑制了家蠶細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而保障并促進(jìn)了家蠶微粒子在家蠶細(xì)胞內(nèi)的增殖過程。本研究揭示了家蠶微粒子調(diào)控家蠶細(xì)胞物質(zhì)能量代謝和細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,不僅為家蠶微粒子病的防控奠定了基礎(chǔ),同時也為人感染微孢子蟲病的防治提供了新的思路和靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S884.21
【圖文】：

圖 1.1 微孢子蟲成熟孢子結(jié)構(gòu)圖[30]；EN. 孢子內(nèi)壁；M. 棒狀極管；Pl. 片狀極膜層；VPl. 囊狀極膜；Sp. 孢原質(zhì)；Nu. 細(xì)胞核；Pm. 孢原質(zhì)膜；PV. 后極泡。agram of a microsporidian spore[30]. EX. Electron-dense exospore; EN.. manubroid; Pl. Lamellar polaroplast; VPl. Vesicular polaroplast; AD. e; Sp. Sporoplasm; Nu. Nucleus; Pm. Plasm membrane; PV. Posterior va蟲的侵染機(jī)制蟲侵染宿主細(xì)胞的方式十分獨特，被宿主攝入的孢子在外過彈出極管的方式將感染性的孢原質(zhì)注入到宿主細(xì)胞的細(xì)管進(jìn)入宿主細(xì)胞的機(jī)制存在兩種假說，一種假說認(rèn)為孢子后在強(qiáng)大的作用力下使極管刺穿宿主細(xì)胞膜而進(jìn)入宿主細(xì)為，微孢子蟲彈出的極絲，在極絲蛋白（特別是 PTP1）與作用下進(jìn)入宿主細(xì)胞[33]（圖 1.2）。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，微噬作用進(jìn)入細(xì)胞，再通過彈出極管的方式逃離宿主形成的

4圖 1.2 微孢子蟲侵染宿主細(xì)胞的不同方式[34]Sporont：母孢子；Meront：裂殖體；Spore：孢子；Sporoblast：孢子母細(xì)胞。Figure 1.2 Microsporidia invade host cells by different approach[34].1.1.3 微孢子蟲的生活史微孢子蟲的生活史大致可以分為 3 個階段，即感染期（infective phase）、裂殖增殖期（proliferative phase）以及孢子增殖期（sporognic phase），其中感染期是位于宿主細(xì)胞外具有侵染能力的階段，其他兩個階段是位于宿主細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育階段[36]（圖 1.3）。在感染期，環(huán)境中的成熟孢子彈出極管并刺入宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，孢原質(zhì)通過彈出的極管進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)中[33,37,38]。剛由孢子釋放出的孢原質(zhì)（又稱

第一章 文獻(xiàn)綜述體）由未分化的細(xì)胞質(zhì)及來源于極膜層的細(xì)胞膜構(gòu)成，隨后在短時間內(nèi)細(xì)胞分化并形成了一層真正的細(xì)胞膜，并合成內(nèi)網(wǎng)膜成為球形細(xì)胞，這樣便進(jìn)入殖增殖期或營養(yǎng)生殖期[37]。在裂殖增殖期，芽體在宿主細(xì)胞內(nèi)仍保持圓形和，在吸收宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量后體積逐漸增大，隨后芽體以二分裂或多分漸增大發(fā)育為裂殖體，然后雙核合二為一形成只具有單核的芽體裂殖體，并為母孢子，此過程反復(fù)進(jìn)行，母孢子數(shù)量增加，從而進(jìn)入孢子增殖期[37]。在增殖期，母孢子以二分裂方式形成孢子母細(xì)胞，并由孢子母細(xì)胞發(fā)育成為成孢子，標(biāo)志著一個生活史的完成[37]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 李田;齊曉冉;陶美林;劉顯林;康定榮;秦國偉;潘國慶;周澤揚;;4種微孢子蟲的分泌蛋白的比較基因組學(xué)分析[J];蠶業(yè)科學(xué);2013年03期

2 李田;劉顯林;韓冰;齊曉冉;康定榮;秦國偉;黨曉群;潘國慶;周澤揚;;家蠶微孢子蟲全基因組分泌蛋白的預(yù)測分析[J];蠶業(yè)科學(xué);2013年02期

3 潘國慶;賀元莉;楊洋;趙麗芳;賈俊杰;周小偉;劉婷;黨曉群;周澤揚;;家蠶微孢子蟲CQ1分離株侵染家蠶的組織病理學(xué)觀察[J];蠶業(yè)科學(xué);2013年02期

4 羅貴娟;繆明永;;己糖激酶Ⅱ與腫瘤研究進(jìn)展[J];中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)(電子版);2013年01期

本文編號：2805903