【摘要】：桑樹是桑屬的多年生木本植物,在中國擁有悠久的栽培歷史。桑葉不僅是蠶桑的重要原料,也可作為中國的傳統(tǒng)中藥,具有抗凝血和降血壓的效果。桑樹在自然生長過程中易受病原物侵擾,發(fā)生病害。桑樹皺葉病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)是近年報道的一種新的雙生病毒,在全國很多蠶區(qū)有報道,其與桑樹皺葉病的相關(guān)性還未通過柯赫氏法則確定,所以其對桑樹的危害無法進行評估。由于缺乏有效的化學(xué)藥劑用于植物病毒的防治,早診斷、早處理是目前防治病毒病通過苗木傳播的有效方法,所以建立高效、高靈敏度且簡單的檢測體系可以有效的預(yù)防MCLV的傳播。本文的研究內(nèi)容包括桑樹皺葉病毒NASH檢測方法的建立和應(yīng)用以及桑樹皺葉病毒實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)檢測方法的建立和應(yīng)用。1、桑樹皺葉病毒NASH檢測方法的建立和應(yīng)用:使用非放射性物質(zhì)地高辛作為標記物,通過隨機引物標記法獲得具有高靈敏度和特異性的DNA探針,通過優(yōu)化雜交時間以及上樣量,建立了桑樹皺葉病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)的核酸斑點雜交(nucleic acid spot hybridization,NASH)檢測體系。與PCR檢測結(jié)果相比建立的NASH檢測體系準確率達93.1%。利用建立的NASH技術(shù)對江蘇省鎮(zhèn)江市3個不同地塊(A、B、C)采集的60個桑葉樣品進行檢測以分析該病毒在該地區(qū)的分布情況及與桑樹病毒樣病害的關(guān)系,結(jié)果顯示,A地塊檢出率20%,B地塊檢出率90%,C地塊檢出率95%,平均檢出率68.3%,說明MCLV在該地區(qū)分布廣泛;另外,在某些無任何病毒樣癥狀植株上檢出MCLV,而在某些有明顯花葉或萎縮癥狀的植株上未檢測出MCLV,說明MCLV可能與桑樹上的花葉或萎縮癥狀無明顯關(guān)聯(lián)。2、桑樹皺葉病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立和應(yīng)用:根據(jù)MCLV外殼蛋白序列,設(shè)計特異性引物,以MCLV陽性的桑葉樣品提取的總DNA為模板,通過PCR獲得了MCLV cp基因的全長序列(738nt)。經(jīng)克隆及測序,確定該序列與GenBank登錄(KR131749)的MCLV cp基因的序列完全一致。根據(jù)獲得的cp基因的全長核苷酸序列,設(shè)計了3對用于qPCR的引物,以含有cp基因全長序列的重組質(zhì)粒作為模板,通過PCR篩選出2條引物適合用于real-time PCR。以含有cp基因全長序列的重組質(zhì)粒作為qPCR的標準品,對標準品進行10倍梯度稀釋。以梯度稀釋的樣品為模板,通過SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR構(gòu)建標準曲線。結(jié)果顯示,其中1條引物構(gòu)建的標準曲線回歸方程為y=-3.433x+12.925,擴增效率為95.6%,相關(guān)系數(shù)為0.998;熔解曲線只有一個特異峰,并且沒有明顯的引物二聚體或非特異性擴增峰,證明該引物具有特異性;通過計算,構(gòu)建的real-time PCR對MCLV檢測靈敏度≥47.8 copies/μl,每個梯度樣品的變異系數(shù)均小于1.56%。說明標準曲線可信,該條引物特異,檢測靈敏度高,重復(fù)性好。而另一條引物因為構(gòu)建的標準曲線不能形成線性關(guān)系而不適合用于qPCR。利用qPCR對大田樣品檢測結(jié)果顯示,15個樣品都為MCLV陽性,結(jié)果與常規(guī)PCR檢測結(jié)果一致。實時熒光定量PCR不僅可用于田間大量樣品的檢測,還可對樣品中MCLV進行定量分析,比PCR檢測更具有優(yōu)勢。
【學(xué)位授予單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S888.7

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本文編號：2798240