發(fā)布時(shí)間：2020-08-20 17:27

【摘要】：桑樹(shù)是桑屬的多年生木本植物,在中國(guó)擁有悠久的栽培歷史。桑葉不僅是蠶桑的重要原料,也可作為中國(guó)的傳統(tǒng)中藥,具有抗凝血和降血壓的效果。桑樹(shù)在自然生長(zhǎng)過(guò)程中易受病原物侵?jǐn)_,發(fā)生病害。桑樹(shù)皺葉病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)是近年報(bào)道的一種新的雙生病毒,在全國(guó)很多蠶區(qū)有報(bào)道,其與桑樹(shù)皺葉病的相關(guān)性還未通過(guò)柯赫氏法則確定,所以其對(duì)桑樹(shù)的危害無(wú)法進(jìn)行評(píng)估。由于缺乏有效的化學(xué)藥劑用于植物病毒的防治,早診斷、早處理是目前防治病毒病通過(guò)苗木傳播的有效方法,所以建立高效、高靈敏度且簡(jiǎn)單的檢測(cè)體系可以有效的預(yù)防MCLV的傳播。本文的研究?jī)?nèi)容包括桑樹(shù)皺葉病毒NASH檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用以及桑樹(shù)皺葉病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用。1、桑樹(shù)皺葉病毒NASH檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用:使用非放射性物質(zhì)地高辛作為標(biāo)記物,通過(guò)隨機(jī)引物標(biāo)記法獲得具有高靈敏度和特異性的DNA探針,通過(guò)優(yōu)化雜交時(shí)間以及上樣量,建立了桑樹(shù)皺葉病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)的核酸斑點(diǎn)雜交(nucleic acid spot hybridization,NASH)檢測(cè)體系。與PCR檢測(cè)結(jié)果相比建立的NASH檢測(cè)體系準(zhǔn)確率達(dá)93.1%。利用建立的NASH技術(shù)對(duì)江蘇省鎮(zhèn)江市3個(gè)不同地塊(A、B、C)采集的60個(gè)桑葉樣品進(jìn)行檢測(cè)以分析該病毒在該地區(qū)的分布情況及與桑樹(shù)病毒樣病害的關(guān)系,結(jié)果顯示,A地塊檢出率20%,B地塊檢出率90%,C地塊檢出率95%,平均檢出率68.3%,說(shuō)明MCLV在該地區(qū)分布廣泛;另外,在某些無(wú)任何病毒樣癥狀植株上檢出MCLV,而在某些有明顯花葉或萎縮癥狀的植株上未檢測(cè)出MCLV,說(shuō)明MCLV可能與桑樹(shù)上的花葉或萎縮癥狀無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。2、桑樹(shù)皺葉病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用:根據(jù)MCLV外殼蛋白序列,設(shè)計(jì)特異性引物,以MCLV陽(yáng)性的桑葉樣品提取的總DNA為模板,通過(guò)PCR獲得了MCLV cp基因的全長(zhǎng)序列(738nt)。經(jīng)克隆及測(cè)序,確定該序列與GenBank登錄(KR131749)的MCLV cp基因的序列完全一致。根據(jù)獲得的cp基因的全長(zhǎng)核苷酸序列,設(shè)計(jì)了3對(duì)用于qPCR的引物,以含有cp基因全長(zhǎng)序列的重組質(zhì)粒作為模板,通過(guò)PCR篩選出2條引物適合用于real-time PCR。以含有cp基因全長(zhǎng)序列的重組質(zhì)粒作為qPCR的標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋。以梯度稀釋的樣品為模板,通過(guò)SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,其中1條引物構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=-3.433x+12.925,擴(kuò)增效率為95.6%,相關(guān)系數(shù)為0.998;熔解曲線只有一個(gè)特異峰,并且沒(méi)有明顯的引物二聚體或非特異性擴(kuò)增峰,證明該引物具有特異性;通過(guò)計(jì)算,構(gòu)建的real-time PCR對(duì)MCLV檢測(cè)靈敏度≥47.8 copies/μl,每個(gè)梯度樣品的變異系數(shù)均小于1.56%。說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線可信,該條引物特異,檢測(cè)靈敏度高,重復(fù)性好。而另一條引物因?yàn)闃?gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線不能形成線性關(guān)系而不適合用于qPCR。利用qPCR對(duì)大田樣品檢測(cè)結(jié)果顯示,15個(gè)樣品都為MCLV陽(yáng)性,結(jié)果與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果一致。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不僅可用于田間大量樣品的檢測(cè),還可對(duì)樣品中MCLV進(jìn)行定量分析,比PCR檢測(cè)更具有優(yōu)勢(shì)。
【學(xué)位授予單位】：江蘇科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S888.7

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本文編號(hào)：2798240