【摘要】：獼猴桃因其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被譽(yù)為“水果之王”。近年來(lái),隨著獼猴桃栽培面積的不斷增長(zhǎng),其病害情況也日益嚴(yán)重,尤其是獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的發(fā)生,該病害致病性強(qiáng)、傳播速度快,能夠在短時(shí)間內(nèi)造成植株的大面積死亡,嚴(yán)重影響了世界獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了闡明獼猴桃應(yīng)答潰瘍病菌侵染的分子機(jī)制,本研究選取國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)獼猴桃子平臺(tái)中29個(gè)獼猴桃品種(系),對(duì)其抗病性進(jìn)行評(píng)價(jià);選擇其中高抗品種‘華特’和高感品種‘紅陽(yáng)’作為材料,利用RNA-Seq測(cè)序技術(shù),分析了獼猴桃在受到病原菌Pseudomonas syringae pv.actinidiae(Psa)侵染后不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)變化,篩選出了4類與抗病相關(guān)的基因;并在此基礎(chǔ)上,詳細(xì)研究了植物病程相關(guān)蛋白1(PR-1)的結(jié)構(gòu)和功能。主要研究結(jié)果如下:1.獼猴桃品種(系)潰瘍病抗性鑒定及不同評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)性分析(1)對(duì)29個(gè)不同獼猴桃品種(系)離體枝條接種Psa,逐日觀察癥狀發(fā)現(xiàn):接種6天后,部分品種(系)開始發(fā)病,接種點(diǎn)變紅褐色,有少量或者溢出乳白色黏液,隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng),病斑直徑也越來(lái)越大。在接種21天后,計(jì)算枝條的病情指數(shù),對(duì)其抗病性進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn),C2-72、C紅陽(yáng)表現(xiàn)為高感(HS),D6-65、C1-74、CHort16-A、D14-57、D6-20表現(xiàn)為感病(S),C2-43、C金桃、C金艷、D優(yōu)系-52表現(xiàn)為耐病(T),D徐香、D海沃德、D布魯諾、A紅寶石星、ASE1-5、AP1-2、AP4-2、EN4-32、AP6-1、AP3-3、A11-17、EN4-25、EN14-9、D金魁和D陶木里表現(xiàn)為抗病(R),EN12-16、EN12-31和E華特表現(xiàn)為高抗(HR),以上結(jié)果表明不同獼猴桃品種(系)抗病性存在顯著性差異,其中中華獼猴桃抗病性最差,美味獼猴桃抗病性次之,軟棗和毛花獼猴桃抗病性最高。(2)對(duì)離體枝條病斑長(zhǎng)度和病情指數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果表明兩者呈現(xiàn)極顯著性正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r為0.957,病情指數(shù)越高,病斑長(zhǎng)度越大,說(shuō)明病斑長(zhǎng)度也可以作為獼猴桃潰瘍病病害鑒定的重要指標(biāo)。(3)用流式細(xì)胞儀對(duì)29個(gè)獼猴桃品種(系)進(jìn)行倍性檢測(cè),結(jié)果表明4倍體中華類型品種抗病性要強(qiáng)于2倍體中華類型品種,而在種間,倍性對(duì)抗性的影響不大。2.高抗品種‘華特’和高感品種‘紅陽(yáng)’在受到Psa侵染后的轉(zhuǎn)錄組分析(1)從‘華特’和‘紅陽(yáng)’不同時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因分析可以看出,在受到Psa侵染后,抗病品種‘華特’能夠迅速的響應(yīng)Psa的侵染,推測(cè)獼猴桃對(duì)潰瘍病菌的防御反應(yīng)可能集中在侵染12h前的早期反應(yīng),早期的差異表達(dá)基因可能在抗病反應(yīng)中起到更重要的防御作用。(2)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明在‘華特’和‘紅陽(yáng)’中有5個(gè)模塊的基因表達(dá)存在著顯著的差異。對(duì)這5個(gè)模塊中的基因進(jìn)行了KEGG富集分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),MEgreenyellow模塊和MEyellow模塊的差異表達(dá)基因主要富集在植物-病原相互作用(Plant-pathogen interaction)、內(nèi)吞作用(Endocytosis),在MEblack模塊的差異表達(dá)基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)、植物-病原相互作用(Plant-pathogen interaction),這些可能都是與獼猴桃響應(yīng)抗病反應(yīng)密切相關(guān)的途徑。3.以高抗品種‘華特’和高感品種‘紅陽(yáng)’為材料,分別克隆其病程相關(guān)蛋白1基因的cDNA序列,命名為htPR-1和hyPR-1。(1)htPR-1和hyPR-1基因全長(zhǎng)都是522bp,不含內(nèi)含子,不同的是htPR-1和hyPR-1 cDNA序列有12個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生了突變,導(dǎo)致其中編碼的7個(gè)氨基酸不同,即發(fā)生了非同義突變。但是最終都是編碼了173個(gè)氨基酸,這說(shuō)明堿基位點(diǎn)的突變并沒有導(dǎo)致翻譯的提前終止。(2)生物信息學(xué)分析表明,與擬南芥及煙草PR-1相似,htPR-1和hyPR-1都具有SCP-PR-1-like保守結(jié)構(gòu)域,N-端都具有一個(gè)26個(gè)氨基酸序列的信號(hào)肽,亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析其是一種分泌蛋白。不同的是,htPR-1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)具有5個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)和3個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu),hyPR-1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)則具有5個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)和4個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu),這表明htPR-1和hyPR-1基因就是PR-1在獼猴桃中的同源基因。(3)通過(guò)多序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)htPR-1和hyPR-1基因與多種植物的PR-1基因具有很高的同源性,其中與番茄、馬鈴薯同源性較高,親緣關(guān)系較近,聚為一類,而與玉米的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示,在受到病原菌Psa侵染后,PR-1基因在‘華特’和‘紅陽(yáng)’中都被顯著誘導(dǎo),但是其在‘華特’中的表達(dá)量要顯著高于‘紅陽(yáng)’(5倍),這表明PR-1基因可能參與了獼猴桃響應(yīng)Psa侵染的免疫應(yīng)答反應(yīng)。(5)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,pCAM35s-PR-1-GFP融合蛋白的綠色熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。(6)為了研究htPR-1和hyPR-1基因的功能,分別構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將htPR-1和hyPR-1基因瞬時(shí)表達(dá)到本氏煙草中,在接種Psa第14天時(shí)觀察癥狀,結(jié)果發(fā)現(xiàn)htPR-1和hyPR-1基因都可以增強(qiáng)煙草對(duì)Psa的抗性。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S436.634.1
【圖文】：

圖 1.1 紅陽(yáng)獼猴桃感染細(xì)菌性潰瘍病的癥狀（李黎等 2013）A-C：主干產(chǎn)生乳白色黏液；D：木質(zhì)部變紅褐色；E：葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，病斑周圍伴有黃色暈圈；F-G：花蕾、幼芽和嫩枝感病后枯萎。Fig.1.1 The symptoms of bacterial canker disease infection in Hongyang kiwifruitA-C: The trunk overflows milky white mucus; D: Reddening of the xylem; E: Leaf with brown spots surroundedby yellow halos; F-G: Buds, shoots and twigs wilting.

物也進(jìn)化出了相應(yīng)的抗性蛋白（R 蛋白）直接或者間接的識(shí)別病原效應(yīng)因?qū)е参锂a(chǎn)生 ETI 反應(yīng)，效應(yīng)因子被 R 蛋白識(shí)別后，又可通過(guò)自我修飾作用釋放出新的效應(yīng)因子繼續(xù)引發(fā)新的 ETS 反應(yīng)，隨后植物也繼續(xù)進(jìn)化出新的白來(lái)特異性識(shí)別效應(yīng)因子，引起新的 ETI 反應(yīng)（圖 1.2）。

獼猴桃應(yīng)答潰瘍病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組研究及抗性相關(guān)基因挖掘、激活 Ca2+離子通道、促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生等，植物產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)（圖 1.3）。

【參考文獻(xiàn)】

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1 張亞真;張芬;王麗鴛;韋康;成浩;;植物谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶在類黃酮累積中的作用[J];植物生理學(xué)報(bào);2015年11期

2 馬立功;孟慶林;張勻華;劉志華;王志英;;向日葵谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及抗病功能研究[J];中國(guó)油料作物學(xué)報(bào);2015年05期

3 石志軍;張慧琴;肖金平;楊魯瓊;孫志偉;謝鳴;馬遠(yuǎn);;不同獼猴桃品種對(duì)潰瘍病抗性的評(píng)價(jià)[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2014年03期

4 史嬋;陳薇蘭;王靜;賀閩;陳學(xué)偉;李偉滔;;三份重要水稻資源的稻瘟病抗性鑒定及不同評(píng)價(jià)指標(biāo)間的相關(guān)性分析[J];植物保護(hù)學(xué)報(bào);2014年04期

5 張慧琴;毛雪琴;肖金平;章鎮(zhèn);謝鳴;;獼猴桃潰瘍病病原菌分子鑒定與抗性材料初選[J];核農(nóng)學(xué)報(bào);2014年07期

6 李文奇;王芳權(quán);王軍;范方軍;朱金燕;楊杰;邵敏;仲維功;;水稻P450基因Oscyp71Z2增強(qiáng)稻瘟病抗性的機(jī)制[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年13期

7 涂美艷;莊啟國(guó);馬鳳仙;陳棟;;獼猴桃潰瘍病秋冬季綜合防控技術(shù)[J];北方園藝;2014年04期

8 韓粉霞;韓廣振;孫君明;張金巍;于紹軒;閆淑榮;楊華;;44份大豆微核心種質(zhì)抗菌核病鑒定與評(píng)價(jià)[J];作物學(xué)報(bào);2013年10期

9 李黎;鐘彩虹;李大衛(wèi);張勝菊;黃宏文;;獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的研究進(jìn)展[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年05期

10 袁偉;萬(wàn)紅建;楊悅儉;;番茄Pto抗病基因家族的鑒定[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2013年01期

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2 付麗;辣椒疫霉（Phytophthora capsici）果膠裂解酶基因克隆及功能研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

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1 劉瑩;番茄丁香假單胞菌抗病基因Pto互作蛋白功能分析[D];合肥工業(yè)大學(xué);2017年

2 張弛;紅陽(yáng)獼猴桃四倍體誘導(dǎo)及其抗?jié)儾√匦猿跆絒D];西南大學(xué);2011年

3 鄧祥宜;淹水脅迫及白粉病菌誘導(dǎo)小麥根細(xì)胞程序化死亡的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2797069