【摘要】：獼猴桃因其具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)被譽為“水果之王”。近年來,隨著獼猴桃栽培面積的不斷增長,其病害情況也日益嚴重,尤其是獼猴桃細菌性潰瘍病的發(fā)生,該病害致病性強、傳播速度快,能夠在短時間內(nèi)造成植株的大面積死亡,嚴重影響了世界獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了闡明獼猴桃應答潰瘍病菌侵染的分子機制,本研究選取國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺獼猴桃子平臺中29個獼猴桃品種(系),對其抗病性進行評價;選擇其中高抗品種‘華特’和高感品種‘紅陽’作為材料,利用RNA-Seq測序技術,分析了獼猴桃在受到病原菌Pseudomonas syringae pv.actinidiae(Psa)侵染后不同時間點的基因表達變化,篩選出了4類與抗病相關的基因;并在此基礎上,詳細研究了植物病程相關蛋白1(PR-1)的結構和功能。主要研究結果如下:1.獼猴桃品種(系)潰瘍病抗性鑒定及不同評價指標的相關性分析(1)對29個不同獼猴桃品種(系)離體枝條接種Psa,逐日觀察癥狀發(fā)現(xiàn):接種6天后,部分品種(系)開始發(fā)病,接種點變紅褐色,有少量或者溢出乳白色黏液,隨著接種時間的延長,病斑直徑也越來越大。在接種21天后,計算枝條的病情指數(shù),對其抗病性進行評價,結果發(fā)現(xiàn),C2-72、C紅陽表現(xiàn)為高感(HS),D6-65、C1-74、CHort16-A、D14-57、D6-20表現(xiàn)為感病(S),C2-43、C金桃、C金艷、D優(yōu)系-52表現(xiàn)為耐病(T),D徐香、D海沃德、D布魯諾、A紅寶石星、ASE1-5、AP1-2、AP4-2、EN4-32、AP6-1、AP3-3、A11-17、EN4-25、EN14-9、D金魁和D陶木里表現(xiàn)為抗病(R),EN12-16、EN12-31和E華特表現(xiàn)為高抗(HR),以上結果表明不同獼猴桃品種(系)抗病性存在顯著性差異,其中中華獼猴桃抗病性最差,美味獼猴桃抗病性次之,軟棗和毛花獼猴桃抗病性最高。(2)對離體枝條病斑長度和病情指數(shù)進行了相關性分析,結果表明兩者呈現(xiàn)極顯著性正相關,相關系數(shù)r為0.957,病情指數(shù)越高,病斑長度越大,說明病斑長度也可以作為獼猴桃潰瘍病病害鑒定的重要指標。(3)用流式細胞儀對29個獼猴桃品種(系)進行倍性檢測,結果表明4倍體中華類型品種抗病性要強于2倍體中華類型品種,而在種間,倍性對抗性的影響不大。2.高抗品種‘華特’和高感品種‘紅陽’在受到Psa侵染后的轉(zhuǎn)錄組分析(1)從‘華特’和‘紅陽’不同時間點差異表達基因分析可以看出,在受到Psa侵染后,抗病品種‘華特’能夠迅速的響應Psa的侵染,推測獼猴桃對潰瘍病菌的防御反應可能集中在侵染12h前的早期反應,早期的差異表達基因可能在抗病反應中起到更重要的防御作用。(2)基因共表達網(wǎng)絡分析結果表明在‘華特’和‘紅陽’中有5個模塊的基因表達存在著顯著的差異。對這5個模塊中的基因進行了KEGG富集分析,結果發(fā)現(xiàn),MEgreenyellow模塊和MEyellow模塊的差異表達基因主要富集在植物-病原相互作用(Plant-pathogen interaction)、內(nèi)吞作用(Endocytosis),在MEblack模塊的差異表達基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)、植物-病原相互作用(Plant-pathogen interaction),這些可能都是與獼猴桃響應抗病反應密切相關的途徑。3.以高抗品種‘華特’和高感品種‘紅陽’為材料,分別克隆其病程相關蛋白1基因的cDNA序列,命名為htPR-1和hyPR-1。(1)htPR-1和hyPR-1基因全長都是522bp,不含內(nèi)含子,不同的是htPR-1和hyPR-1 cDNA序列有12個位點堿基發(fā)生了突變,導致其中編碼的7個氨基酸不同,即發(fā)生了非同義突變。但是最終都是編碼了173個氨基酸,這說明堿基位點的突變并沒有導致翻譯的提前終止。(2)生物信息學分析表明,與擬南芥及煙草PR-1相似,htPR-1和hyPR-1都具有SCP-PR-1-like保守結構域,N-端都具有一個26個氨基酸序列的信號肽,亞細胞定位預測分析其是一種分泌蛋白。不同的是,htPR-1二級結構預測具有5個α-螺旋結構和3個β-折疊結構,hyPR-1二級結構預測則具有5個α-螺旋結構和4個β-折疊結構,這表明htPR-1和hyPR-1基因就是PR-1在獼猴桃中的同源基因。(3)通過多序列比對和構建進化樹分析,發(fā)現(xiàn)htPR-1和hyPR-1基因與多種植物的PR-1基因具有很高的同源性,其中與番茄、馬鈴薯同源性較高,親緣關系較近,聚為一類,而與玉米的親緣關系較遠。(4)實時熒光定量PCR分析結果顯示,在受到病原菌Psa侵染后,PR-1基因在‘華特’和‘紅陽’中都被顯著誘導,但是其在‘華特’中的表達量要顯著高于‘紅陽’(5倍),這表明PR-1基因可能參與了獼猴桃響應Psa侵染的免疫應答反應。(5)亞細胞定位實驗結果表明,pCAM35s-PR-1-GFP融合蛋白的綠色熒光主要分布在細胞質(zhì)和細胞膜上。(6)為了研究htPR-1和hyPR-1基因的功能,分別構建過表達載體,通過農(nóng)桿菌介導的方法將htPR-1和hyPR-1基因瞬時表達到本氏煙草中,在接種Psa第14天時觀察癥狀,結果發(fā)現(xiàn)htPR-1和hyPR-1基因都可以增強煙草對Psa的抗性。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S436.634.1
【圖文】：

圖 1.1 紅陽獼猴桃感染細菌性潰瘍病的癥狀（李黎等 2013）A-C：主干產(chǎn)生乳白色黏液；D：木質(zhì)部變紅褐色；E：葉片出現(xiàn)褐色斑點，病斑周圍伴有黃色暈圈；F-G：花蕾、幼芽和嫩枝感病后枯萎。Fig.1.1 The symptoms of bacterial canker disease infection in Hongyang kiwifruitA-C: The trunk overflows milky white mucus; D: Reddening of the xylem; E: Leaf with brown spots surroundedby yellow halos; F-G: Buds, shoots and twigs wilting.

物也進化出了相應的抗性蛋白（R 蛋白）直接或者間接的識別病原效應因?qū)е参锂a(chǎn)生 ETI 反應，效應因子被 R 蛋白識別后，又可通過自我修飾作用釋放出新的效應因子繼續(xù)引發(fā)新的 ETS 反應，隨后植物也繼續(xù)進化出新的白來特異性識別效應因子，引起新的 ETI 反應（圖 1.2）。

獼猴桃應答潰瘍病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組研究及抗性相關基因挖掘、激活 Ca2+離子通道、促進蛋白質(zhì)的翻譯和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生等，植物產(chǎn)生免疫應答反應（圖 1.3）。

【參考文獻】

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本文編號：2797069