發(fā)布時間：2020-08-17 09:39

【摘要】：桑螟Glyphodes pyloalis屬鱗翅目Lepidoptera、螟蛾科Pyralidae,是桑樹重大害蟲之一。由于其生殖周期短、繁殖量大、防治困難,在條件適宜時短期便能暴發(fā)成災(zāi),嚴重影響桑蠶產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展。生產(chǎn)上目前常用的化學防治方法極易導致害蟲抗性,產(chǎn)生和引起養(yǎng)蠶中毒,迫切需要研發(fā)新的桑螟防治手段。近年來,基于昆蟲化學生態(tài)學原理,以引誘技術(shù)為代表的新型害蟲防治手段日益得到重視并不斷取得良好的防治效果。本論文在構(gòu)建桑螟觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上,鑒定桑螟觸角中化學感受基因與氣味降解酶基因,分析基因的序列特征及系統(tǒng)進化關(guān)系,驗證代表性嗅覺相關(guān)基因的組織表達模式并構(gòu)建原核表達體系,明確OBPs配體競爭結(jié)合特性和GSTs的體外催化活性。1.利用Illumina測序平臺構(gòu)建了桑螟觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,共獲得51,776,602個clean reads,并拼接出33,461個unigenes,N50值為1968。經(jīng)blastx相似性分析,這些unigenes與臍橙螟Amyelois transitella相似度最高。從桑螟觸角轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出25個氣味結(jié)合蛋白基因GpOBPs、4個信息素結(jié)合蛋白基因GpPBPs、4個一般氣味結(jié)合蛋白基因GpGOBPs、20個化學感受蛋白基因GpCSPs、53個氣味受體基因GpORs、19個離子型受體基因GpIRs、2個感覺神經(jīng)元膜蛋白基因GpSNMPs。2.熒光定量PCR結(jié)果表明,20個GpOBPs在桑螟成蟲觸角中高度表達,推測這些基因可能在桑螟化學信號感受過程中發(fā)揮重要作用;11個GpOBPs在桑螟成蟲腹部高度表達,2個在桑螟成蟲胸部高度表達,推測這些GpOBPs可能在桑螟體內(nèi)生理活動中發(fā)揮作用。GpOBP1、GpOBP10、GpOBP13、GpOBP16和GpOBP21同時在桑螟成蟲觸角和腹部中表達,且表達具有性別差異性。鑒于GpOBP12和GpPBP1基因在雄性桑螟觸角中高度表達,進一步對這2個基因進行體外大量表達和純化。將這2個基因分別構(gòu)建到pEASY和pET32a表達載體中,然后在大腸桿菌E.coli中經(jīng)IPTG誘導表達。分析表明,GpPBP1/pET32a和GpOBP12/pEASY分別在33kDa和18kDa處有一明顯加粗帶,重組蛋白經(jīng)HisTrap~TMM FF crude柱親和層析得到純化后的蛋白。體外競爭結(jié)合實驗表明,重組GpPBP1蛋白對植物揮發(fā)物β-紫羅蘭酮具有結(jié)合能力(IC_(50)=28.7μM;Ki=2.0317μM)。3.從桑螟觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定得到18個氣味降解酶基因,包括15個谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶基因GpGSTs和3個醛氧化酶基因GpAOXs。其中,GSTs可分為Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta 6個大類。保守結(jié)構(gòu)域分析表明,8個GpGSTs具有GSH結(jié)合域,13個GpGSTs具有底物結(jié)合域。熒光定量PCR結(jié)果表明,GpGST-D1和3個GpAOXs在雌雄成蟲觸角中高度表達,推測它們可能參與桑螟觸角中氣味和信息素的降解過程。GpGST-O1和GpGST-O2在雌成蟲觸角中的表達量高于其他組織,GpGST-D3在雌成蟲腹部的表達量最高,但與雄成蟲觸角中的表達量無顯著差異。除GpGST-D3外,10個GpGSTs(GpGST-D2、GpGSTD4、GpGST-E1、GpGST-E2、GpGST-E3、GpGST-T1、GpGST-Z1、GpGST-S1、GpGST-S2、GpGST-S3)在桑螟成蟲腹部的表達量也高于其他組織,但呈現(xiàn)出性別差異性。進一步對GpGST-D1進行體外大量表達和純化。將該基因構(gòu)建到pEASY表達載體中,然后在大腸桿菌E.coli中經(jīng)IPTG誘導表達。SDS-PAGE分析表明,GpGST-D1在25kDa處有一明顯加粗帶。重組蛋白經(jīng)HisTrap~(TM) FF crude親和層析得到純化后的蛋白。考察了不同溫度和pH單因素條件下GpGST-D1重組蛋白的酶學性質(zhì),結(jié)果表明,在溫度為50℃時,酶活達到最高,為44.95±0.67μmol/min/mg;在pH為7.0時,酶活達到最高,為36.68±0.38μmol/min/mg。在桑螟中開展嗅覺機制研究,不僅有利于揭示不同嗅覺相關(guān)基因在桑螟嗅覺體系中的作用和功能,闡明桑螟嗅覺感知的完整過程,也可為桑螟的化學生態(tài)學研究提供參考,從而為研發(fā)基于嗅覺靶標的新型桑螟防治手段提供支持。
【學位授予單位】：江蘇科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S888.722

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張彩萍;;桑螟暴發(fā)原因分析與防控措施[J];蠶桑通報;2018年02期

2 陳偉國;戴建忠;董瑞華;張芬;楊一平;;2014年秋季桑螟暴發(fā)的為害與原因[J];蠶桑通報;2015年02期

3 周鑫;周萬成;楊明方;陳馨梅;;秋季桑螟大暴發(fā)防治方法探討[J];江蘇蠶業(yè);2012年03期

4 葛小興;;室內(nèi)越冬代桑螟撲殺措施的探討[J];蠶桑通報;2012年04期

5 方利民;朱福官;丁海紅;穆蘭芳;周君;;春季桑螟的發(fā)生特點與防治對策[J];蠶桑通報;2011年04期

6 陳小青;朱方容;;早期預測預防 桑螟死光光[J];廣西蠶業(yè)(科普版);2007年01期

7 萬從芹;楊成平;;桑螟的防治技術(shù)與效果[J];蠶桑茶葉通訊;2007年06期

8 秦翠綠;;桑螟的發(fā)生及防治[J];四川蠶業(yè);2006年02期

9 方利民;;秋期桑螟的發(fā)生及原因分析[J];中國蠶業(yè);2006年04期

10 劉桂州;申小軍;顧全中;;我縣桑螟暴發(fā)的預警方法探討[J];山東蠶業(yè);2006年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 陳偉國;;環(huán)境因子對桑螟越冬的影響[A];2014年全國桑樹病蟲防控學術(shù)研討會論文集[C];2014年

2 唐正方;張義軍;;鹽城市中部地區(qū)桑螟大量暴發(fā)原因及其防治對策(摘要)[A];紀念六足學會創(chuàng)建八十周年、江蘇省昆蟲學會四十周年論文集粹[C];2000年

3 吳華;嚴余高;張鳳春;唐正方;;鹽城市中部地區(qū)桑螟大暴發(fā)原因及其防治對策[A];中國蠶學會養(yǎng)蠶與蠶生理病理學術(shù)討論會論文匯編[C];2000年

4 李民;谷利群;王榮根;朱建華;;2014年浙北蠶區(qū)桑螟大暴發(fā)原因分析與對策措施[A];2014年全國桑樹病蟲防控學術(shù)研討會論文集[C];2014年

5 蘇航;王華兵;;桑螟殺蟲劑抗性研究進展[A];浙江省科協(xié)服務(wù)科技創(chuàng)新項目——推進蠶桑產(chǎn)業(yè)傳承發(fā)展論壇論文集[C];2017年

6 孫緒艮;陳永杰;張衛(wèi)光;牟志剛;郭光智;;桑螟越冬幼蟲體內(nèi)生化物質(zhì)的變化與抗寒性的關(guān)系[A];中國蠶學會第五次全國桑保學術(shù)研討會論文集[C];2004年

7 施國方;白錫川;陳夢姣;趙麗華;金衛(wèi)明;徐森華;;桑螟幼蟲對毒死蜱抗性調(diào)查[A];2014年全國桑樹病蟲防控學術(shù)研討會論文集[C];2014年

8 胡桂萍;曹紅妹;;桑螟性信息素迷向防治效果研究[A];綠色植保與鄉(xiāng)村振興——中國植物保護學會2018年學術(shù)年會論文集[C];2018年

9 浦冠勤;于軍香;毛建萍;謝立群;張秋俠;周月明;黃宗福;;桑螟的生物防治研究[A];昆蟲學創(chuàng)新與發(fā)展——中國昆蟲學會2002年學術(shù)年會論文集[C];2002年

10 陳小青;朱方容;陸瑞好;林強;朱光書;;頻振式殺蟲燈在控制桑樹害蟲上的應(yīng)用探討[A];中國蠶學會桑樹病蟲害防治學術(shù)研討會論文集[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前3條

1 繆梅玲;夏秋季桑園防桑螟危害[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報;2012年

2 海安縣蠶桑站供稿;綜防桑園害蟲 主治四代桑螟[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報;2010年

3 省農(nóng)林廳植保站供稿;秋季桑樹病蟲害重于去年 五代桑螟將在蘇南大發(fā)生[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報;2009年

相關(guān)碩士學位論文 前6條

1 宋文淼;桑螟嗅覺相關(guān)基因的鑒定、組織表達譜及體外表達的研究[D];江蘇科技大學;2019年

2 李靜;桑螟β-呋喃果糖苷酶基因的克隆與功能研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2014年

3 李玉林;桑螟性腺提取物的GC-MS分析及低溫誘導轉(zhuǎn)錄組和代謝組學研究[D];江蘇科技大學;2017年

4 鄭煜;混腔室繭蜂的寄主選擇與發(fā)育策略及其對桑螟的營養(yǎng)與免疫調(diào)控[D];江蘇科技大學;2017年

5 王學剛;對桑螟高毒的蘇云金芽胞桿菌菌株的篩選及其特性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2007年

6 王衛(wèi)明;吳江市桑螟災(zāi)變規(guī)律及預警技術(shù)研究[D];蘇州大學;2007年

本文編號：2795151