【摘要】：桑螟Glyphodes pyloalis屬鱗翅目Lepidoptera、螟蛾科Pyralidae,是桑樹重大害蟲之一。由于其生殖周期短、繁殖量大、防治困難,在條件適宜時短期便能暴發(fā)成災,嚴重影響桑蠶產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展。生產(chǎn)上目前常用的化學防治方法極易導致害蟲抗性,產(chǎn)生和引起養(yǎng)蠶中毒,迫切需要研發(fā)新的桑螟防治手段。近年來,基于昆蟲化學生態(tài)學原理,以引誘技術為代表的新型害蟲防治手段日益得到重視并不斷取得良好的防治效果。本論文在構建桑螟觸角轉錄組數(shù)據(jù)庫的基礎上,鑒定桑螟觸角中化學感受基因與氣味降解酶基因,分析基因的序列特征及系統(tǒng)進化關系,驗證代表性嗅覺相關基因的組織表達模式并構建原核表達體系,明確OBPs配體競爭結合特性和GSTs的體外催化活性。1.利用Illumina測序平臺構建了桑螟觸角轉錄組數(shù)據(jù)庫,共獲得51,776,602個clean reads,并拼接出33,461個unigenes,N50值為1968。經(jīng)blastx相似性分析,這些unigenes與臍橙螟Amyelois transitella相似度最高。從桑螟觸角轉錄組中共鑒定出25個氣味結合蛋白基因GpOBPs、4個信息素結合蛋白基因GpPBPs、4個一般氣味結合蛋白基因GpGOBPs、20個化學感受蛋白基因GpCSPs、53個氣味受體基因GpORs、19個離子型受體基因GpIRs、2個感覺神經(jīng)元膜蛋白基因GpSNMPs。2.熒光定量PCR結果表明,20個GpOBPs在桑螟成蟲觸角中高度表達,推測這些基因可能在桑螟化學信號感受過程中發(fā)揮重要作用;11個GpOBPs在桑螟成蟲腹部高度表達,2個在桑螟成蟲胸部高度表達,推測這些GpOBPs可能在桑螟體內生理活動中發(fā)揮作用。GpOBP1、GpOBP10、GpOBP13、GpOBP16和GpOBP21同時在桑螟成蟲觸角和腹部中表達,且表達具有性別差異性。鑒于GpOBP12和GpPBP1基因在雄性桑螟觸角中高度表達,進一步對這2個基因進行體外大量表達和純化。將這2個基因分別構建到pEASY和pET32a表達載體中,然后在大腸桿菌E.coli中經(jīng)IPTG誘導表達。分析表明,GpPBP1/pET32a和GpOBP12/pEASY分別在33kDa和18kDa處有一明顯加粗帶,重組蛋白經(jīng)HisTrap~TMM FF crude柱親和層析得到純化后的蛋白。體外競爭結合實驗表明,重組GpPBP1蛋白對植物揮發(fā)物β-紫羅蘭酮具有結合能力(IC_(50)=28.7μM;Ki=2.0317μM)。3.從桑螟觸角轉錄組中鑒定得到18個氣味降解酶基因,包括15個谷胱甘肽硫-轉移酶基因GpGSTs和3個醛氧化酶基因GpAOXs。其中,GSTs可分為Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta和Zeta 6個大類。保守結構域分析表明,8個GpGSTs具有GSH結合域,13個GpGSTs具有底物結合域。熒光定量PCR結果表明,GpGST-D1和3個GpAOXs在雌雄成蟲觸角中高度表達,推測它們可能參與桑螟觸角中氣味和信息素的降解過程。GpGST-O1和GpGST-O2在雌成蟲觸角中的表達量高于其他組織,GpGST-D3在雌成蟲腹部的表達量最高,但與雄成蟲觸角中的表達量無顯著差異。除GpGST-D3外,10個GpGSTs(GpGST-D2、GpGSTD4、GpGST-E1、GpGST-E2、GpGST-E3、GpGST-T1、GpGST-Z1、GpGST-S1、GpGST-S2、GpGST-S3)在桑螟成蟲腹部的表達量也高于其他組織,但呈現(xiàn)出性別差異性。進一步對GpGST-D1進行體外大量表達和純化。將該基因構建到pEASY表達載體中,然后在大腸桿菌E.coli中經(jīng)IPTG誘導表達。SDS-PAGE分析表明,GpGST-D1在25kDa處有一明顯加粗帶。重組蛋白經(jīng)HisTrap~(TM) FF crude親和層析得到純化后的蛋白。考察了不同溫度和pH單因素條件下GpGST-D1重組蛋白的酶學性質,結果表明,在溫度為50℃時,酶活達到最高,為44.95±0.67μmol/min/mg;在pH為7.0時,酶活達到最高,為36.68±0.38μmol/min/mg。在桑螟中開展嗅覺機制研究,不僅有利于揭示不同嗅覺相關基因在桑螟嗅覺體系中的作用和功能,闡明桑螟嗅覺感知的完整過程,也可為桑螟的化學生態(tài)學研究提供參考,從而為研發(fā)基于嗅覺靶標的新型桑螟防治手段提供支持。
【學位授予單位】：江蘇科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S888.722

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本文編號：2795151