【摘要】：滯育(diapause)是昆蟲(chóng)重要的生理狀態(tài),主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育的停滯和生理活動(dòng)的降低,應(yīng)對(duì)外界不利的條件以保持物種的延續(xù)。柞蠶(Antheraea pernyi)是以蛹滯育的鱗翅目大蠶蛾科柞蠶屬的泌絲昆蟲(chóng),是我國(guó)特色的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)。柞蠶蛹進(jìn)入滯育及解除滯育是柞蠶種保護(hù)及制種的重要環(huán)節(jié),而關(guān)于其激素調(diào)控機(jī)制的研究是實(shí)現(xiàn)人為控制柞蠶不同化性地區(qū)柞蠶蛹羽化制種的基礎(chǔ)。因此,關(guān)于柞蠶滯育及滯育解除機(jī)制的研究對(duì)于柞蠶生產(chǎn)、闡明機(jī)制具有重要意義。選取沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)柞蠶研究所保育的“沈黃2號(hào)”和河南省蠶業(yè)研究所保育的“豫大1號(hào)”為材料,運(yùn)用分子生物學(xué)方法,研究柞蠶滯育及解除滯育過(guò)程中羽化激素、脫殼啟動(dòng)激素和脫殼啟動(dòng)激素受體基因以及糖代謝調(diào)控中的海藻糖酶基因的表達(dá)規(guī)律,為闡明柞蠶蛹滯育及其解除滯育機(jī)制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果如下:1.柞蠶羽化激素基因的克隆及表達(dá)模式研究根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的柞蠶中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選注釋為羽化激素基因的Unigene序列,利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,克隆獲得了柞蠶羽化激素基因ApEH。ApEH基因的ORF序列全長(zhǎng)為267 bp,編碼88個(gè)氨基酸;半定量RT-PCR檢測(cè)ApEH基因在柞蠶蛹滯育期和發(fā)育期各個(gè)組織中表達(dá)情況,ApEH在柞蠶蛹滯育期和發(fā)育期的腦和滯育期的精巢/卵巢中高表達(dá),在發(fā)育期體壁高表達(dá),在其它組織中微量表達(dá)。采用qRT-PCR檢測(cè)長(zhǎng)光照處理滯育蛹后,ApEH的表達(dá)量在0至21 d之間維持在較低的表達(dá)水平,而在21 d時(shí)EH的表達(dá)量開(kāi)始升高,第35 d達(dá)到最高(為預(yù)蛹的15.85倍),之后開(kāi)始下降,49 d達(dá)到最低。結(jié)合呼吸強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果,長(zhǎng)光照加速解除柞蠶滯育并促進(jìn)其發(fā)育,表明柞蠶滯育蛹在長(zhǎng)光照處理20天以內(nèi),沒(méi)有啟動(dòng)羽化程序,21天以后開(kāi)始啟動(dòng)羽化程序。2.柞蠶脫殼啟動(dòng)激素和脫殼啟動(dòng)激素受體基因的克隆及表達(dá)模式研究根據(jù)柞蠶中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物�？寺～@得了柞蠶脫殼啟動(dòng)激素和脫殼啟動(dòng)激素受體基因,分別命名為ApETH和ApETHR-A。2個(gè)基因的ORF序列全長(zhǎng)分別為264 bp、1 653 bp,分別編碼87、550個(gè)氨基酸。半定量RT-PCR檢測(cè)這2個(gè)基因在柞蠶蛹滯育期和發(fā)育期各個(gè)組織中表達(dá)情況,ApETHR-A在柞蠶蛹滯育期和發(fā)育期的腦中高表達(dá);ApETH在滯育期的體壁中高表達(dá),在發(fā)育期精巢/卵巢中高表達(dá),在其它組織中不表達(dá);ApETHR-A在滯育期精巢/卵巢中高表達(dá),在發(fā)育期體壁高表達(dá),在其它組織中都微量表達(dá)。采用qRT-PCR檢測(cè)長(zhǎng)光照處理滯育蛹后,ApETH在幼蟲(chóng)剛化蛹而體壁未硬化和黑化時(shí)(俗稱“神仙蛹”)時(shí)表達(dá)量較高,長(zhǎng)光照處理滯育蛹后,開(kāi)始下降,在處理21 d時(shí),表達(dá)量最低,隨后開(kāi)始升高,在49 d時(shí),表達(dá)量最高;ApETHR-A先升高,在0 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量較高,長(zhǎng)光照處理滯育蛹后,慢慢下降,起伏不定,在35 d時(shí)表達(dá)量最低,在光照49 d時(shí),表達(dá)量最高。表明柞蠶蛹臨近羽化過(guò)程中,羽化激素、脫殼啟動(dòng)激素和脫殼啟動(dòng)激素受體基因的表達(dá)變化趨勢(shì)基本呈一致性,提示3個(gè)基因的表達(dá)響應(yīng)在柞蠶蛹臨近羽化中發(fā)揮重要作用。3.柞蠶蛹滯育和滯育解除過(guò)程中海藻糖酶基因的克隆及表達(dá)模式研究根據(jù)柞蠶中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物�？寺～@得了柞蠶3個(gè)海藻糖酶基因,分別命名為ApTreh1A,ApTreh1B和ApTreh2(GenBank登錄號(hào)分別為:KU977455,KU977456和KU977457),開(kāi)放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)分別為1 797、1635、1 932 bp,分別編碼598、544、643個(gè)氨基酸。同源序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,ApTreh1A和ApTreh1B為可溶型海藻糖酶(TrehS),ApTreh2為膜結(jié)合型海藻糖酶(TrehM)。半定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),各組織中ApTreh2比ApTreh1的分布更廣且表達(dá)量更高。qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ApTreh1A和ApTreh1B在長(zhǎng)光照處理后的柞蠶蛹脂肪體中,21 d時(shí)表達(dá)量都表現(xiàn)出快速升高[分別是對(duì)照組(12L:12D)的2倍和4.7倍],28 d與35d時(shí)下降,42 d時(shí)表達(dá)量再次升高;ApTreh2隨著滯育的解除表達(dá)量逐漸升高,28 d時(shí)達(dá)到最高(約為對(duì)照組的2.7倍),42 d時(shí)又出現(xiàn)一個(gè)小高峰(約2.3倍),后期逐漸下降。4.柞蠶蛹滯育和滯育解除過(guò)程中海藻糖酶活性及海藻糖含量變化研究利用3,5-二硝基水楊酸法檢測(cè)脂肪體中海藻糖酶活力的變化,同時(shí)采用蒽酮比色法測(cè)定其血淋巴中海藻糖含量。長(zhǎng)光照下脂肪體中海藻糖酶活力逐漸升高,21 d時(shí)達(dá)到最高(約18.5 U),35 d時(shí)降到最低(約11.2 U),42 d時(shí)其酶活力再次略微升高,之后呈下降趨勢(shì),與基因表達(dá)變化趨勢(shì)一致。蛹血淋巴中海藻糖含量在長(zhǎng)光照條件下呈現(xiàn)出升高趨勢(shì),21 d時(shí)達(dá)到最高,在整個(gè)發(fā)育時(shí)期的含量比對(duì)照組要高。本研究結(jié)果表明柞蠶蛹滯育解除過(guò)程中海藻糖酶基因表達(dá)的變化與蛹脂肪體中海藻糖酶活性、蛹血淋巴中海藻糖含量的變化趨勢(shì)呈一致性,提示海藻糖酶基因的表達(dá)響應(yīng)在柞蠶蛹滯育解除中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S885.1
【圖文】：

及質(zhì)量檢測(cè)RNA 要求極高，提取的柞蠶 定 RNA 的濃度和質(zhì)量，結(jié)果HR-A 基因的克隆與序列特征為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成克隆的三個(gè)基因的 PCR 長(zhǎng)度基因序列，通過(guò) BlastP 比對(duì)與家蠶 EH、家蠶 ETH、家蠶 E分別將這 3 個(gè)基因命名為 AbpM 1 2 3

精巢/卵巢中高表達(dá)，在發(fā)育期體壁高表達(dá)，在其它組織中都微量表達(dá)。ETH在滯育期的體壁中高表達(dá)，在發(fā)育期精巢/卵巢中高表達(dá)，在其它組織中不表達(dá)。ETHR-A在滯育期精巢/卵巢中高表達(dá)，在發(fā)育期體壁高表達(dá)，在其它組織中都微量表達(dá)（圖3-1）。1: 血淋巴Haemolymph; 2: 中腸Midgut; 3: 體壁Integument ; 4: 精巢/卵巢Spermaries/ovaries; 5: 脂肪體 Fat body; 6: 腦 Brain圖 3-1 半定量 RT-PCR 檢測(cè) EH、ETH、ETHR-A 基因在柞蠶蛹滯育期和發(fā)育期不同組織器官中的表達(dá)量Fig. 3-1 Expression profile of EH、ETH、ETHR-A in different tissues of diapause stage and developmentstage of Antheraea pernyi pupae assayed by semi-quantitative RT-PCR3.5.2 實(shí)時(shí)定量 PCR（qPCR）引物特異性分析qPCR引物特異性是保證qPCR結(jié)果準(zhǔn)確的重要條件之一，在檢測(cè)柞蠶蛹滯育與滯育解除過(guò)程中ApEH、ApETH和ApETHR-A基因的相對(duì)表達(dá)量時(shí)發(fā)現(xiàn)，柞蠶內(nèi)參基因β-actin和ApEH、ApETH和ApETHR-A基因具有不同的溶解峰（圖3-2），沒(méi)有其他的雜峰出現(xiàn)，說(shuō)明qPCR引物具有較好的特異性

圖3-2 qPCR溶解曲線Fig. 3-2 The melting curve of qPCR3.5.3 滯育解除過(guò)程中 ApEH、ApETH 和 ApETHR-A 的表達(dá)量變化采用 qRT-PCR 檢測(cè)柞蠶蛹解除滯育及發(fā)育過(guò)程中 EH、ETH 和 ETHR-A 的相對(duì)表達(dá)量。長(zhǎng)光照處理滯育蛹后，EH 的表達(dá)量在 0 至 21 d 之間維持在較低的表達(dá)水平，而在21 d 時(shí) EH 的表達(dá)量開(kāi)始升高，第 35 d 達(dá)到最高（為預(yù)蛹的 15.85 倍），之后開(kāi)始下降，49 d 達(dá)到最低，短光照處理除了在第 7 d 和第 42 d 較低之外，其余時(shí)間表達(dá)量基本一致（圖 3-3：A）；ETH 在神仙蛹時(shí)表達(dá)量較高，長(zhǎng)光照處理滯育蛹后，開(kāi)始下降，在處理21 d 時(shí)，表達(dá)量最低，隨后開(kāi)始升高，在 49 d 時(shí)，表達(dá)量最高（為預(yù)蛹的 43.12 倍），短光照處理后，表達(dá)量稍微上升，第 14 d 表達(dá)量達(dá)到最高，之后開(kāi)始下降，第 42 d 表達(dá)量最低，第 49 d 稍微上升（圖 3-3：B）；ETHR-A 先升高，在 0 d 時(shí)相對(duì)表達(dá)量較高，長(zhǎng)光照處理滯育蛹后，慢慢下降，起伏不定，在 35 d 時(shí)表達(dá)量最低，在光照 49 d 時(shí)，表達(dá)量最高，短光照處理滯育蛹后，慢慢下降，起伏不定，在 14 d 時(shí)表達(dá)量最低，在光照 42 d 時(shí)，表達(dá)量最高，隨后下降（圖 3-3：C）。

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本文編號(hào)：2792683