【摘要】：核桃葉為植物胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)的樹葉,其資源豐富并存在一定的殺蟲活性。本文研究了核桃葉對三種農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾(Plutella xylostella L.)、棉蚜(Aphis gossypii G.)和菜青蟲(Pieris rapae L.)的殺蟲活性。以參與免疫防御的關(guān)鍵酶-酚氧化酶為靶點進行研究,闡明核桃葉殺蟲的作用機制,為核桃葉靶向殺蟲提供理論依據(jù)。(1)測定核桃葉50%、70%、90%乙醇提取物對小菜蛾、棉蚜和菜青蟲的殺蟲活性。實驗表明:70%乙醇提取物的胃毒活性最強,棉蚜小菜蛾菜青蟲,其中棉蚜施藥30 h和48 h的致死中濃度分別為11.70 mg/mL和5.07 mg/mL;小菜蛾施藥3 d和4 d的致死中濃度分別為16.92 mg/mL,8.31 mg/mL;菜青蟲施藥3 d和4 d的致死中濃度分別為21.55 mg/mL和13.86 mg/mL。70%乙醇提取物對棉蚜的觸殺活性最好,25 mg/mL接觸48 h殺蟲率達到80.15%;90%乙醇提取物對小菜蛾和菜青蟲的觸殺活性最好,同樣條件下殺蟲率達71.23%和56.12%。70%乙醇提取物對小菜蛾的生長抑制效果最好,24 h體重抑制率達34.12%;90%乙醇提取物對菜青蟲的生長抑制效果最好,24 h體重抑制率為41.23%。90%乙醇提取物對三種試蟲拒食活性最強,48 h的非選擇性和選擇性拒食活性均為棉蚜(81.96%,87.74%)菜青蟲(75.75%,79.35%)小菜蛾(61.20%,65.23%)。(2)以小菜蛾為昆蟲模型,探究核桃葉70%乙醇提取物殺蟲的作用機制。實驗表明:核桃葉提取物在給藥初期可以激活小菜蛾體外血淋巴的黑化,3d后黑化又被抑制。中間產(chǎn)物多巴的含量隨著給藥濃度的增加而升高,驗證了核桃葉對黑化反應的激活作用。在蛋白質(zhì)水平上,核桃葉70%乙醇提取物對血淋巴中蛋白含量產(chǎn)生影響,以給藥48 h為分界點,蛋白質(zhì)含量增后降低,變化浮動在10%左右。在血糖水平上,血淋巴中海藻糖的含量隨著提取物濃度的增加而降低,隨著時間的變化在昆蟲體內(nèi)的含量先增加后減少。(3)探究殺蟲過程中靶點-酚氧化酶的活性及蛋白和基因的表達量差異。酶學特性實驗表明:小菜蛾酚氧化酶在pH = 6-6.8范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好,最適pH值為6.4,在20-40℃酶活相對穩(wěn)定,最適溫度為34℃。70%乙醇提取物在體外對小菜蛾酚氧化酶有激活作用,給藥濃度9 mg/mL時,激活率達到35.09%。在體內(nèi)對4齡蟲的激活作用最強,測定對四齡蟲不同組織的激活作用,血淋巴表皮頭部。通過qRT-PCR和SDS-PAGE分別檢測小菜蛾酚氧化酶的mRNA和蛋白的表達情況,結(jié)果均表現(xiàn)出給藥濃度越高其表達量越高的情況,表明70%乙醇提取物至少會促進酚氧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平的表達,是否直接促進翻譯水平的表達還需進一步驗證。
【學位授予單位】：北京化工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ453
【圖文】：

（酚氧化酶原）邐（酚氧化酶）逡逑圖１－５酚氧化酶激活系統(tǒng)逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｐｒｏｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑（ｉ）分子結(jié)構(gòu)逡逑ｍ型銅蛋白家族包括節(jié)肢動物和軟體動物的血藍蛋白，以及微生物、脊椎動物和逡逑植物的氧化還原酶，昆蟲酚氧化酶也是其中一員［５１］。如圖１－６，它可以通過其獨特的逡逑二聚體活性位點ＣｕＡ和ＣｕＢ來進行識別，中心銅原子由三個組氨酸（Ｈｉｓ）來支撐，逡逑和氧在橋接偏移方向0１－十：ｒｆ）結(jié)合［５Ｘ｜，且三個組氨酸殘基分布存在一定的差異。酶逡逑催反應進行時，酚氧化酶雙銅活性中心有三種氧化還原狀態(tài)，分別包括脫氧態(tài)、還原逡逑態(tài)和氧化態(tài)。氧化態(tài)的酶既能催化單酚的羥基化，又能催化鄰苯二酚成相應的醌，而逡逑還原態(tài)的酶只能進行后一個反應。逡逑Ｈｉｓ逡逑ｔ逡逑Ｈｉｓ蠢逡逑曹ＣｕＡ逡逑，、、：：？？Ｈｉｓ逡逑0逡逑？邋Ｈｉｓ逡逑圖１－６酚氧化酶雙銅活性中心逡逑Ｆｉｇ．邋１－６邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ邋ｆｅａｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｃｔｉｖｅ邋ｃｅｎｔｅｒ邋ｏｆ邋ｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ逡逑昆蟲的酚氧化酶與節(jié)肢動物血藍蛋白具有高達４０％的序列同源性［５３】

Ｆｉｇ．２－４邋Ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｌａｒｖａｌ邋ｏｆ邋Ｐｌｕｔｅｌｌａ邋ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ邋Ｌ．邋（Ａ：邋ｆｉｒｓｔ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｂ：邋ｓｅｃｏｎｄ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｃ：邋ｔｈｉｒｄ逡逑ｉｎｓｔａｒ，邋Ｄ：邋ｆｏｕｒｔｈ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｅ：邋ｆｉｆｔｈ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｆ：邋ｐｕｐａｌ邋ｄｕｒａｔｉｏｎ）逡逑對小菜蛾進行觸殺和胃毒實驗，如圖２－５，圖ａ為小菜蛾的觸殺試驗，１為接觸給逡逑藥后小菜蛾的異常行為，身體開始卷曲，用毛刷觸碰后行動緩慢且一直保持卷曲狀態(tài)。逡逑圖ｂ為小菜蛾的胃毒試驗，２為給藥后小菜蛾的失水皺縮情況。圖ｃ和圖ｄ為對照組逡逑和胃毒試驗死亡后的小菜蛾，可以看出小菜蛾在給藥后身體變得干癟，顏色加深變?yōu)殄义虾稚矣妹⒂|碰無反應，表現(xiàn)為死亡。逡逑ａ邋、邐ｂ邋＼邐ｃ邋＾逡逑＞、，、邋錢逡逑Ｊ邋＇邐，、邋ｄ邋身逡逑圖２－５小菜蛾觸殺與胃毒活性對比（ａ：觸殺試驗，ｂ：胃毒試驗，ｃ：對照，ｄ：胃毒死亡，１：異常，２：逡逑失水）逡逑Ｆｉｇ．２－５邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｔａｇ邋ａｎｄ邋ｓｔｏｍａｃｈ邋ｔｏｘｉｃｉｔｙ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｌａｒｖａｌ邋ｏｆ邋Ｐｌｕｔｅｌｌａ邋ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ邋Ｌ．邋（ａ：邋ｔａｇ邋ｔｅｓｔ

１０邋１１邋１２邋１３邋ｔｏ邋１１邋１２邋１３邐１０邋１１邐１３逡逑１０邐１１邐１２邋ＩＳ邋ｔｏ邋１１邐１２邐１３邋１０邐１１邐１２邐１３逡逑圖２－４小菜蛾幼蟲生長周期圖（Ａ：邋ｌ齡，Ｂ：邋２齡，Ｃ：邋３齡．Ｄ：邋４齡，Ｅ：邋５齡，Ｆ：化蛹）逡逑Ｆｉｇ．２－４邋Ｔｈｅ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｙｃｌｅ邋ｏｆ邋ｌａｒｖａｌ邋ｏｆ邋Ｐｌｕｔｅｌｌａ邋ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ邋Ｌ．邋（Ａ：邋ｆｉｒｓｔ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｂ：邋ｓｅｃｏｎｄ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｃ：邋ｔｈｉｒｄ逡逑ｉｎｓｔａｒ，邋Ｄ：邋ｆｏｕｒｔｈ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｅ：邋ｆｉｆｔｈ邋ｉｎｓｔａｒ，邋Ｆ：邋ｐｕｐａｌ邋ｄｕｒａｔｉｏｎ）逡逑對小菜蛾進行觸殺和胃毒實驗，如圖２－５，圖ａ為小菜蛾的觸殺試驗，１為接觸給逡逑藥后小菜蛾的異常行為，身體開始卷曲，用毛刷觸碰后行動緩慢且一直保持卷曲狀態(tài)。逡逑圖ｂ為小菜蛾的胃毒試驗，２為給藥后小菜蛾的失水皺縮情況。圖ｃ和圖ｄ為對照組逡逑和胃毒試驗死亡后的小菜蛾，可以看出小菜蛾在給藥后身體變得干癟，顏色加深變?yōu)殄义虾稚矣妹⒂|碰無反應，表現(xiàn)為死亡。逡逑ａ邋、邐ｂ邋＼邐ｃ邋＾逡逑＞、

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