【摘要】：家蠶(Bombyx mori.)是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)昆蟲,家蠶絲腺合成分泌的蠶絲是絲綢行業(yè)的核心原料與蠶桑產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ),是家蠶經(jīng)濟(jì)價(jià)值的集中體現(xiàn)。近年來,家蠶遺傳操作技術(shù)的研究突飛猛進(jìn)。隨著家蠶基因組圖譜的成功繪制、蠶絲蛋白合成與分泌機(jī)制的解析,目前,以家蠶絲腺與蠶絲為載體,利用遺傳操作技術(shù)生產(chǎn)功能性外源蛋白、改良功能性蠶絲材料的研究已成為主流,其不僅能穩(wěn)固蠶絲當(dāng)前的應(yīng)用市場(chǎng),還可以擴(kuò)展蠶絲的應(yīng)用領(lǐng)域�；谝陨涎芯勘尘�,本研究在家蠶絲腺與蠶絲中重組表達(dá)了人血小板衍生生長因子(PDGF-BB),創(chuàng)制出了更強(qiáng)的促細(xì)胞增殖活性的新型蠶絲。具體研究結(jié)果如下:一、轉(zhuǎn)PDGF家蠶的獲得及分子檢測(cè)人血小板衍生生長因子(PDGF)屬于糖蛋白二聚體家族,存在于人血小板顆粒中,具有強(qiáng)趨化活性及分裂源性,可在傷口愈合、血管重塑及骨修復(fù)等多種生理過程中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果如下:1)人工合成PDGF-BB基因并構(gòu)建家蠶轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,AscⅠ酶切鑒定結(jié)果顯示,已成功構(gòu)建了表達(dá)載體piggyBac[3xp3EGFP,hSPDGFSer1PA];2)將PDGF-BB表達(dá)載體顯微注射后對(duì)后代進(jìn)行熒光篩選,獲得了5個(gè)陽性蛾圈,陽性率為38%;3)基因組PCR結(jié)果表明PDGF基因已成功插入家蠶基因組,利用反向PCR確定其插入位點(diǎn)為26號(hào)染色體Bm_scaff 25;4)RT-PCR結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)基因家蠶中PDGF基因成功發(fā)生轉(zhuǎn)錄,同時(shí)內(nèi)源Ser1基因的轉(zhuǎn)錄水平與正常家蠶相比下降了37.5%;5)從26個(gè)上蔟的陽性家蠶個(gè)體蠶絲中提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,出現(xiàn)特異條帶,大小與理論大小一致;Western Blot結(jié)果表明該處蛋白可與PDGF抗體特異結(jié)合,同時(shí)可檢測(cè)到蛋白二聚體結(jié)構(gòu)。二、轉(zhuǎn)PDGF家蠶蠶絲中重組蛋白的分離純化與活性檢測(cè)PDGF蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞遷移與增殖的活性,為了驗(yàn)證重組表達(dá)的PDGF蛋白是否具有活性,對(duì)轉(zhuǎn)PDGF家蠶個(gè)體繭殼中的重組PDGF蛋白進(jìn)行了純化及蛋白活性檢測(cè)。研究結(jié)果表明:1)使用尿素提取出蠶絲中的絲膠蛋白,根據(jù)PDGF蛋白具有肝素結(jié)合域的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),采用HiTrap~(TM) Heparin HP層析柱進(jìn)行肝素親和層析,得率約為80%;為了提高純化產(chǎn)物的純度,采用HiTrap~(TM) SP HP陽離子交換柱結(jié)合雜蛋白,得率約為70%;采用HiTrap~(TM) Q HP陰離子交換柱結(jié)合雜蛋白,收集流穿液,最終得到純度為82.3%的PDGF蛋白溶液。整個(gè)過程可從1g蠶絲中獲得0.2mg重組蛋白;2)利用血清濃度為0.5%的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行12h的饑餓處理,加入純化的重組蛋白及等量標(biāo)準(zhǔn)品處理24h。EdU染色與CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,純化的PDGF蛋白可維持NIH/3T3細(xì)胞的生長并促進(jìn)細(xì)胞增殖,其活性與等量的標(biāo)準(zhǔn)品相比無明顯差異;3)利用血清濃度為0.5%的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行12h的饑餓處理,用無菌槍頭在細(xì)胞表面進(jìn)行劃痕,隨后加入純化的重組蛋白及等量標(biāo)準(zhǔn)品處理24h。與對(duì)照組相比,加入純化的PDGF蛋白可顯著減小劃痕的面積,同時(shí)遷移出的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組,說明純化的PDGF蛋白可以促進(jìn)NIH/3T3細(xì)胞的遷移,其活性與等量的標(biāo)準(zhǔn)品相比無明顯差異。三、轉(zhuǎn)PDGF蠶絲素材的功能研究當(dāng)機(jī)體組織出現(xiàn)破損時(shí),血小板釋放的PDGF可作為分裂源促進(jìn)多種細(xì)胞增殖,加速傷口愈合。本研究通過家蠶絲腺生物反應(yīng)器在蠶絲中特異表達(dá)PDGF蛋白,期待賦予蠶絲新的生物學(xué)活性,創(chuàng)制出功能性蠶絲素材。研究結(jié)果表明:1)PDGF重組蠶絲在外觀形態(tài)、纖維直徑、二級(jí)結(jié)構(gòu)含量以及力學(xué)性能等方面,與正常蠶絲相比沒有顯著性差異;2)使用PBS可從PDGF重組蠶絲中提取出重組蛋白,持續(xù)提取20天,從90mg重組蠶絲中能夠緩慢、持續(xù)地釋放出13.7μg的PDGF蛋白,占到重組蛋白總含量的45.65%;3)利用血清濃度為10%的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,PDGF重組蠶絲處理細(xì)胞24h后細(xì)胞生長狀態(tài)良好,無明顯死亡,不具有細(xì)胞毒性;4)利用血清濃度為0.5%的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行12h的饑餓處理,加入正常蠶絲、PDGF重組蠶絲與等量標(biāo)準(zhǔn)品處理細(xì)胞24h,EdU染色與CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)的結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,PDGF重組蠶絲不需經(jīng)過處理,便可維持NIH/3T3細(xì)胞的生長并促進(jìn)細(xì)胞增殖,其活性與等量的標(biāo)準(zhǔn)品相比無明顯差異;5)利用血清濃度為0.5%的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行12h饑餓處理,加入正常蠶絲、PDGF重組蠶絲與等量標(biāo)準(zhǔn)品處理細(xì)胞24h,Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,PDGF重組蠶絲不需經(jīng)過處理,可激活ERK通路從而促進(jìn)NIH/3T3細(xì)胞的增殖,其活性與等量的標(biāo)準(zhǔn)品相比無明顯差異。綜上所述,本研究利用家蠶絲腺生物反應(yīng)器,以及高效率的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng),獲得了可在家蠶絲腺及蠶絲中重組表達(dá)有活性的PDGF蛋白的家蠶品系,遺傳改良出了可促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能性蠶絲材料。利用該重組蠶絲材料,有望制備出醫(yī)用傷口敷料,促進(jìn)傷口愈合,在生物醫(yī)藥、組織工程等領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S88
【圖文】：

及促進(jìn)胞外基質(zhì)合成等在內(nèi)的多種演著重要的角色。長因子受體及信號(hào)通路F receptor，PDGFR）屬于酪氨酸激，為單鏈跨膜糖蛋白，存在于多種類形式的亞基，亞基間兩兩結(jié)合可形DGFR-ββ 與 PDGFR-αβ，其結(jié)構(gòu)包括。F-AA、PDGF-BB 和 PDGF-AB 這三與 PDGF-BB 和 PDGF-AB 相互作用而或者自分泌的形式分泌出去，會(huì)與受體活化后形成二聚體，自身發(fā)生磷相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將信號(hào)傳遞至細(xì)細(xì)胞的增殖或遷移[3]（圖 2）。

圖 2 PDGF 信號(hào)通路[2]Figure 2 PDGF signal pathway生長因子的應(yīng)用DGF 沉默不表達(dá)，當(dāng)出現(xiàn)創(chuàng)傷或炎癥等過細(xì)胞等細(xì)胞類型中表達(dá)組成型，從血小板 PDGF 具有強(qiáng)的趨化活性及分裂源性，可有絲分裂的過程，從而應(yīng)用于多種領(lǐng)域。于促進(jìn)傷口愈合。由兩條 PDGF-B 鏈組成圖 3）中最早出現(xiàn)的物質(zhì)之一，對(duì)于血管，PDGF 通過與細(xì)胞表面的 PDGFR 結(jié)合直接作用，在傷口愈合過程中出現(xiàn)的眾多因生長因子 β（transforming growth factor betfibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等[5]，PDG同作用，加速傷口愈合。

圖 2 PDGF 信號(hào)通路[2]Figure 2 PDGF signal pathway生生長因子的應(yīng)用 PDGF 沉默不表達(dá)，當(dāng)出現(xiàn)創(chuàng)傷或炎癥等過程肌細(xì)胞等細(xì)胞類型中表達(dá)組成型，從血小板顆于 PDGF 具有強(qiáng)的趨化活性及分裂源性，可以胞有絲分裂的過程，從而應(yīng)用于多種領(lǐng)域。于促進(jìn)傷口愈合。由兩條 PDGF-B 鏈組成的（圖 3）中最早出現(xiàn)的物質(zhì)之一，對(duì)于血管平子，PDGF 通過與細(xì)胞表面的 PDGFR 結(jié)合直直接作用，在傷口愈合過程中出現(xiàn)的眾多因子生長因子 β（transforming growth factor beta，（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等[5]，PDGF協(xié)同作用，加速傷口愈合。

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本文編號(hào)：2791454