【摘要】：茶尺蠖作為茶園重要食葉害蟲,其發(fā)生世代數(shù)多、繁殖快、容易暴發(fā)成災(zāi),嚴(yán)重影響著茶樹正常生長(zhǎng)發(fā)育、茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。選育抗茶尺蠖的茶樹品種可以從根本上解決茶尺蠖取食為害的問(wèn)題。本研究通過(guò)對(duì)茶樹葉片表型結(jié)構(gòu)觀察和葉片對(duì)茶尺蠖幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響,選取‘上梅州’作為抗蟲品種(RG)和‘平陽(yáng)特早茶’作為感蟲品種(SG)進(jìn)行蟲害后茶樹轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和代謝產(chǎn)物分析,探究抗性品種對(duì)茶尺蠖產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制,挖掘茶樹關(guān)鍵抗性基因和次生代謝物,并對(duì)關(guān)鍵抗性基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析,克隆了關(guān)鍵抗性基因并對(duì)其進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。主要研究結(jié)果如下:1.通過(guò)觀察‘上梅州’(MZ)、‘碧云’(BY)、‘龍井長(zhǎng)葉’(LC)、‘九龍茶’(GL)、‘藍(lán)山苦茶單株’(LS)、‘龍井43’(LJ)、‘白毫早’(BH)、‘茴香茶’(HX)、‘大方貢茶’(DF)、‘福云六號(hào)’(FY)、‘浙農(nóng)113’(ZN)、‘平陽(yáng)特早茶’(PY)這12個(gè)茶樹品種葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu),MZ、BH、HX、DF、GL、ZN這六種茶樹葉片具有2~3層緊密排列的柵欄組織,而PY、FY、LC、LJ、LS、BY這六種茶樹的柵欄組織有2層細(xì)胞組成,且排列松散。12種茶樹葉片喂養(yǎng)茶尺蠖幼蟲,發(fā)現(xiàn)幼蟲對(duì)MZ、BY、DF和HX這五個(gè)品種的取食量明顯少于PY,且幼蟲增重量和取食量呈正相關(guān)。MZ葉片喂養(yǎng)的幼蟲體重最輕,體積最小;PY葉片喂養(yǎng)的幼蟲體積最大,生長(zhǎng)狀況最好。GL、PY品種的幼蟲化蛹數(shù)比較高,HX、BY和MZ品種的幼蟲化蛹數(shù)較低。在取食選擇試驗(yàn)中,1齡幼蟲對(duì)MZ和LJ有很大的選擇性;2齡幼蟲對(duì)MZ和FY具有較大的取食傾向性;3齡幼蟲對(duì)LS、GL和HX具有傾向性,對(duì)MZ傾向性較小。幼蟲對(duì)MZ的選擇隨著齡期的增加變小,對(duì)PY的取食選擇隨著齡期增加變化幅度不大。計(jì)算幼蟲的取食選擇指數(shù),發(fā)現(xiàn)PY的取食選擇指數(shù)最大,MZ的取食選擇指數(shù)小于PY。因此,綜合葉片解剖結(jié)構(gòu)、幼蟲食葉量和蟲增重、幼蟲取食選擇和取食選擇指數(shù)、以及化蛹數(shù)和死亡數(shù),選取‘上梅州’(MZ)作為抗蟲品種(RG)和‘平陽(yáng)特早茶’(PY)作為感蟲品種(SG)進(jìn)行后續(xù)的研究分析。2.通過(guò)對(duì)茶尺蠖為害后的RG和SG代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析,分別找到了75和74個(gè)差異表達(dá)代謝物。這些代謝物主要包括類黃酮、氨基酸及其衍生物、脂肪酸、核酸及其衍生物。相較于對(duì)照植株,蟲害后的茶樹植株中類黃酮代謝途徑活躍且代謝物含量增加。表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素(GC)和兒茶素(C)在RG中水平顯著增加,同時(shí)山奈酚、花翠素、槲皮素、原花色素和原花青素在SG中水平顯著增加;茉莉酸(JA)作為植物響應(yīng)害蟲侵害的重要植物激素,在RG中被大量誘導(dǎo)合成,而在SG中只有茉莉酸的羥基化衍生物被發(fā)現(xiàn);蟲害后,RG代謝中果糖的水平受到了顯著抑制,而在SG中果糖含量呈極顯著增加;RG中水楊酸(SA)含量很低,而在SG中SA被顯著誘導(dǎo)合成。在差異代謝物富集代謝通路中,RG和SG的差異代謝物主要參與了類黃酮生物合成途徑和苯丙烷類生物合成途徑,可見這兩個(gè)途徑在茶樹抗茶尺蠖反應(yīng)中起著重要作用。3.RG和SG的對(duì)照處理和蟲害處理的揮發(fā)物種類和釋放量存在差異。茶尺蠖幼蟲取食為害后,RG和SG的兩個(gè)處理中揮發(fā)物的種類和釋放量變多變大,其中β-Myrcene、E-3,7-dimethyl-1,3,6-Octatriene、3,7-dimethyl-1,6-Octadien-3-ol、α-Cyclopentene、α-Farnesene、Squalene、(2Z)-2-Pentenyl acetate、4-Methyl tetradecane等萜烯類化合物和(E)-2-Hexenal、(E)-3-Hexen-1-ol、(Z)-2-Hexen-1-ol脂肪酸類衍生物的釋放量顯著增加。蟲害后的植株中,β-Myrcene、E-3,7-dimethyl-1,3,6-Octatriene、3,7-dimethyl-1,6-Octadien-3-ol、α-Cyclopentene、α-Farnesene、Squalene、(2Z)-2-Pentenyl acetate、4-Methyl tetradecane、(E)-2-Hexenal、(E)-3-Hexen-1-ol、(Z)-2-Hexen-1-ol的釋放量RG要多于SG,且差異顯著。其中,α-Farnesene、Squalene、(E)-3-Hexen-1-ol、(Z)-2-Hexen-1-ol等萜烯類化合物和脂肪酸類衍生物在蟲害后的RG植株中釋放量顯著增加。4.本研究利用Illumina HiSeq2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)蟲害后RG和SG的六個(gè)文庫(kù)(Cs_P1、Cs_P2、Cs_P3、Cs_M1、Cs_M2和Cs_M3)進(jìn)行測(cè)序,共得到了704,798,092條高質(zhì)量的reads,獲得了342961個(gè)unigenes,它們的長(zhǎng)度介于201~15022 bp,平均長(zhǎng)度594bp,N50長(zhǎng)度為834 bp。注釋到的unigenes有18456條,占所有unigenes的5.38%。93667(27.31%)條unigenes被成功進(jìn)行了GO注釋;51793(15.1%)條unigenes被注釋到了KOG的26個(gè)類群中。獲得14260條差異表達(dá)基因(padj0.05),其中7587條表達(dá)上調(diào)基因,6673條表達(dá)下調(diào)基因。茶尺蠖為害后,RG中的碳水化合物(淀粉和蔗糖,果糖和甘露糖)代謝和氨基酸(D-谷氨酰胺和D-谷氨酸鹽,半胱氨酸和蛋氨酸)代謝都比SG中活躍。另一方面,在RG中與類苯丙烷(二萜、類倍半萜和三萜類化合物生物合成)相關(guān)的代謝途徑都很活躍且代謝物含量升高。相較于SG,RG的茉莉酸合成途徑基因FAD7A-1、LOX2.1和JMT的表達(dá)量都很高;參與類黃酮生物合成途徑的酚類和花青素生物合成的限速酶,PAL和LDOX在RG中表達(dá)量升高。另外,催化萜烯類化合物合成的關(guān)鍵酶類,萜烯合酶基因(TPS03、TPS04和TPS21)在RG中的表達(dá)量同樣上升。7587條上調(diào)表達(dá)基因主要和脂類修飾、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、木質(zhì)部發(fā)育和轉(zhuǎn)運(yùn)(離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和修飾氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn))有關(guān),同時(shí)也參與了磷酸化作用、代謝進(jìn)程(己糖、氧化還原輔酶、木質(zhì)素、類苯丙烷和類異戊二烯代謝)、防御反應(yīng)(氣孔關(guān)閉調(diào)節(jié)、對(duì)植食性昆蟲防御反應(yīng)和對(duì)其他生物的防御反應(yīng))和植物激素信號(hào)傳導(dǎo)(脫落酸、細(xì)胞分裂素和茉莉酸)。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析中,997條基因成功映射到了擬南芥上,其中59個(gè)TFs和44個(gè)PKs被發(fā)現(xiàn)分別與894個(gè)節(jié)點(diǎn)和24294個(gè)邊緣關(guān)聯(lián)緊密。蛋白網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)TFs(MYB308/108、WRKY41/75、NAC062、和MYC4)與61個(gè)其它基因相互作用緊密,33個(gè)PKs(LRR-RLK、Ser/Thr kinase、CDPK、和MAPK家族)和271個(gè)其它基因相互作用緊密。5.從茶樹各個(gè)組織的轉(zhuǎn)錄組中,篩選得到149條NBS編碼序列。這些NBS蛋白序列又被分為7個(gè)種類CC-NBS-LRR(52)、TIR-NBS-LRR(3)、CC-NBS(25)、TIRNBS(3)、NBS(20)、NBS-LRR(40)和RPW8-NBS(6)。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)量分析,選取Cs4100(CsNBS-1)和CS187031(CsNBS-2)進(jìn)行全長(zhǎng)克隆和煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。6.CsNBS-1和CsNBS-2基因序列全長(zhǎng)分別是3696 bp和3718 bp,都屬于CNL類型,ORF區(qū)域分別長(zhǎng)2748 bp和2706 bp,分別編碼915和901個(gè)氨基酸。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化,一共得到41株卡納霉素抗性的陽(yáng)性植株。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.711
【圖文】：

食植物主要受到植物體外部物理結(jié)構(gòu)和內(nèi)部化學(xué)成分的影響，物理結(jié)構(gòu)可以阻礙或減緩昆蟲的取食，主要包括植物葉片的軟硬程度、葉齡大小以及葉片表面附著物等，化學(xué)成分可以限制昆蟲對(duì)營(yíng)養(yǎng)的攝取，主要包括一些次生代謝物和他感化合物（朱麟 1998）。這些物質(zhì)的存在，使昆蟲在取食植物的時(shí)候，受到了一定的限制。1.1.2 植物表型結(jié)構(gòu)對(duì)昆蟲的抗性植物體莖葉表面的茸毛、角質(zhì)層、表皮厚度硬度、細(xì)胞組成及部分組織的硅化程度等形態(tài)結(jié)構(gòu)都會(huì)對(duì)昆蟲形成積極的防御作用（Maxwell1980;Loprestietal2017）。茸毛作為植物表皮的附屬物，具有能夠保持水分、防衛(wèi)和平衡植物體內(nèi)外環(huán)境等作用，也是植物抵抗害蟲的第一道防線，體表茸毛的性狀、長(zhǎng)短和密度會(huì)在一定程度上影響到昆蟲的附著、取食行為和產(chǎn)卵等（欽俊德 1987）。如棉花葉面和葉柄上的茸毛可以阻礙棉紅鈴蟲初孵幼蟲的爬行（Smith2005）；大豆葉片上布滿的密生的茸毛可以阻礙蠶豆微葉蟬的取食（Taylor 1956）；馬鈴薯葉片表面的腺毛可以阻攔桃蚜的取食（Lapointe 1986）。作

強(qiáng)、過(guò)氧化氫酶活性下降（茍長(zhǎng)青 2018）。害誘導(dǎo)植物揮發(fā)物 HIPVsHIPVs 的形成害誘導(dǎo)植物揮發(fā)物（Herbivore-induced plant volatiles, HIPVs）作為間接防性研究中具有重要的意義。在多種多樣的生態(tài)系統(tǒng)中，HIPVs 能夠調(diào)節(jié)植生物、未受害的緊鄰健康植物或者未受害部位之間的相當(dāng)大量的相mura et al 2009）。它是植物-昆蟲-天敵三者之間協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。植物在受害后，害蟲口腔分泌物效應(yīng)子侵入植物細(xì)胞，誘導(dǎo)植物釋放大量的揮發(fā)性發(fā)物具有引誘害蟲天敵的目的。HIPVs 在影響害蟲取食行為的作用上較為遭受害蟲危害后，植物體會(huì)產(chǎn)生一些具有抗蟲性的次生代謝物，為了避免爭(zhēng)和天敵昆蟲，害蟲會(huì)避開蟲害植株去選擇寄主，如小麥被高密度的蚜蟲危

1.3.1 NBS 類抗性基因的發(fā)現(xiàn)和鑒定Biezen 和 Jones（1998）在研究調(diào)控秀麗隱桿線蟲細(xì)胞程序性死亡的基因（ced-4）時(shí)，發(fā)現(xiàn)該基因和大多數(shù)植物抗病性基因具有相同的結(jié)構(gòu)，即核酸綁定位點(diǎn)（NBS）和亮氨酸拉鏈區(qū)域（LRR）。在過(guò)去的研究中，已經(jīng)在多種植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)和分析了大量的 R基因（Dangl & Jones 2001）。NBS-LRR 抗性基因占 R 基因的很大一部分，達(dá)到 60.8%（Funk et al 2018）。在病原侵入位點(diǎn)，抗性基因產(chǎn)物能夠造成迅速的局部宿主細(xì)胞程序性死亡，且用肉眼就可以觀察。作為植物抗性機(jī)制的關(guān)鍵組成部分，大量的抗性基因都有一個(gè)共同的特征：核酸綁定位點(diǎn)（nucleotide-binding sites, NBS）和亮氨酸拉鏈區(qū)域（leucine-richrepeatregion,LRR）（McHaleetal2006）。NBS 區(qū)域能夠綁定水解三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate,ATP）和三磷酸尿苷（Guanosinetriphosphate,GTP），在抗性信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起作用（Takken et al 2006; Tameling et al 2006）。由于 NBS 結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性，因此常用來(lái)作為鑒別 NBS-LRR 類基因的依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2789148