發(fā)布時間：2020-08-07 06:41

【摘要】：擬禾本科根結(jié)線蟲(Meloidogyne graminicola)是水稻種植系統(tǒng)中危害最為嚴(yán)重的病原線蟲之一。目前廣泛應(yīng)用的化學(xué)殺線蟲劑對環(huán)境危害較大且使用成本較高,亟待篩選出對環(huán)境有益且易于推廣的綠色防控技術(shù)來替代化學(xué)殺線蟲劑。本研究以擬禾本科根結(jié)線蟲為研究對象,通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段鑒定了一株生防真菌AW2017,通過優(yōu)化殺線蟲代謝產(chǎn)物的發(fā)酵工藝,探究了最適宜的發(fā)酵培養(yǎng)條件;通過室內(nèi)生測和盆栽試驗、巨細胞組織切片及水稻防御相關(guān)基因的表達分析,進一步明確百歲蘭曲霉對擬禾本科根結(jié)線蟲的作用機制,以期為開發(fā)防控擬禾本科根結(jié)線蟲的生防菌劑、發(fā)展綠色防控技術(shù)提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:經(jīng)形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)分析,AW2017菌株與曲霉屬形態(tài)非常相似、且Cam與BenA基因與百歲蘭曲霉的同源性分別高達75%和89%,從而將AW2017鑒定為百歲蘭曲霉(Aspergillus welwitschiae)。通過室內(nèi)生物測定,評價了百歲蘭曲霉孢子懸浮液對水稻根結(jié)線蟲幼蟲和卵的毒力,發(fā)現(xiàn)5×AW2017處理72 h后,根結(jié)線蟲幼蟲死亡率高達86.2%;處理8天后,根結(jié)線蟲卵孵化抑制率達47.3%,表明百歲蘭曲霉孢子懸浮液對水稻根結(jié)線蟲幼蟲有良好的毒殺作用,對于卵孵化也有較好的抑制作用。通過室內(nèi)接種實驗,測定了百歲蘭曲霉孢子懸浮液對根結(jié)線蟲行為的影響。誘集實驗表明,與PDB對照相比,在距離接種中心1.5-3.0cm和3.0-4.5cm的區(qū)域,5×AW2017處理分別可降低線蟲的遷移率37.3%和39.6%,侵入根部的線蟲減退率高達64.9%。溫室盆栽實驗表明,施用5×AW2017孢子懸浮液后,根結(jié)數(shù)量可降低24.5%,根內(nèi)侵入的線蟲數(shù)量減少40.5%,且侵入的線蟲發(fā)育進程明顯延緩。顯微切片結(jié)果表明,AW2017處理后的巨細胞比對照表面積減小了77.6%,發(fā)育明顯延遲。說明AW2017減少水稻根系對擬禾本科根結(jié)線蟲的誘集作用,減少根內(nèi)線蟲的侵入數(shù)量并抑制其發(fā)育。在原有搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上,對百歲蘭曲霉在500 L發(fā)酵罐中產(chǎn)生殺線蟲活性代謝物的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。確定了接種體積為8%、通氣量為4m~3/h、溶氧水平為25%的菌種最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件,同時明確了菌種最佳發(fā)酵培養(yǎng)時間為120h。在該條件下,以PDB為對照,AW2017的線蟲校正死亡率高達91.3%,說明該發(fā)酵體系可用于AW2017殺線蟲活性物質(zhì)的量化生產(chǎn)。通過qRT-PCR分析,初步研究了AW2017對水稻防御相關(guān)基因表達的影響。分別在接種6h和72h后,AW2017發(fā)酵液處理的水稻根系內(nèi)ET合成相關(guān)基因OsACO7和OsACS1的相對表達量明顯上調(diào);但測試時間內(nèi)ET響應(yīng)基因OsERF1、OsERF70、OsEBP89以及調(diào)控基因OsEIN2的相對表達量變化不顯著。此外,AW2017處理后,水稻根內(nèi)其他信號途徑的相關(guān)基因表達量無顯著變化。說明AW2017可能通過誘導(dǎo)ET合成途徑相關(guān)基因表達量上調(diào)來防御根結(jié)線蟲的侵入。綜上所述,百歲蘭曲霉代謝產(chǎn)物可抑制根結(jié)線蟲的侵入和發(fā)育,激活水稻防御相關(guān)基因的表達,能有效控制擬禾本科根結(jié)線蟲的危害,具有良好的開發(fā)應(yīng)用潛力。本研究為開發(fā)水稻根結(jié)線蟲生防菌劑、發(fā)展線蟲綠色防控技術(shù)提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S435.111.4
【圖文】：

子懸浮液0.5ml和10×AW2017孢子懸浮液0.5ml，再加入0.5ml卵懸浮液（200個/ml），PDB為對照，總體積為1ml。每個處理重復(fù)6次，每組試驗重復(fù)三次。將24孔板放到26℃的恒溫箱中孵化并用封口膜封嚴(yán)實，防止孔板內(nèi)水分蒸發(fā)和雜菌污染。分別統(tǒng)計放置4天和8天后線蟲蟲卵孵化的情況，顯微鏡下統(tǒng)計卵和線蟲的數(shù)量，并通過SAS軟件分析卵的孵化率和孵化抑制率（Saikia etal.,2013）。孵化率=（孵化線蟲數(shù)/卵總數(shù)量）×100%，孵化抑制率=（對照組孵化率-處理組孵化率）/對照組孵化率×100%。2.2 結(jié)果分析2.2.1 真菌 AW2017 的形態(tài)學(xué)鑒定真菌 AW2017 在查氏酵母膏瓊脂(CYA)上 25℃培養(yǎng) 5 天后，測得菌落直徑范圍約 43-45mm，較厚, 表面具少量輻射狀皺紋, 邊緣于培養(yǎng)基內(nèi)；質(zhì)地絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生，褐黑色；菌絲體白色夾雜淡黃色；無滲出液和可溶性色素；反面呈淡黃白色。分生孢子頭初期為球形，老后分叉，直徑范圍約 200-400μm；分生孢子梗發(fā)生于培養(yǎng)基內(nèi)部，長×寬大小范圍大約 1000-3000×10-18μm，壁光滑；頂囊球形直徑 40-60μm，全部表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層，梗基的長×寬大小范圍大約 10-20×5-7μm；瓶梗的長×寬大小范圍大約 8-10×2-3μm；分生孢子球形，壁刺狀粗糙（圖 2.1）。

士學(xué)位論文 第二章 百歲蘭曲霉生防真菌的分離鑒定及其對擬禾本科根Fig.2.a.Characteristics of colonies;b-d.Conidiophorc and conidia2017 的分子生物學(xué)鑒定 BenA 基因 ITS 區(qū)片段以及 CAM 基因的 ITS 區(qū)片段經(jīng)過 PCR 擴化、單克隆陽性檢測后送去測序，測得菌株 BenA 基因 ITS 區(qū)片小分別為 556bp 和 616bp（圖 2.2），GenBank 編號分別為 MH021屬與同屬其他種的親緣關(guān)系，將編輯后的序列在 GenBank 上進行下載相似的菌株序列，利用 MEGA6.0 軟件中的鄰位連接法構(gòu)建株 AW2017 的兩個片段均與 A. welwitschiae 在同一分支，其中， welwitschiae CBS 139.54 (FJ629291.1)的同源相似性最高，高達 89%chiae CBS 139.54 (KC480196.1)的同源相似性最高，高達 75%（圖分子生物學(xué)分析，將菌株 AW2017 鑒定為百歲蘭曲霉（A. welwi

13Fig.2.3 The NJ tree inferred from the partial sequences of β-tubulin (A) and calmodulin (B) of Aspergillus welwitschiae.Bootstrap percentages >35% derived from 1000 replicates are indicated at the nodes. Bar=0.02 substitutions pernucleotide position.：分支上數(shù)字表示大于 35%的 Bootstrap 檢驗值（1000 次重復(fù)）

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本文編號：2783632