【摘要】：白腐菌是葡萄危害較嚴(yán)重的病害之一,因此有關(guān)葡萄抗白腐病的研究成為葡萄抗性研究的一個(gè)重要的方向。作為世界葡萄屬植物起源中心之一,我國(guó)擁有很多寶貴的葡萄野生資源,其中一些品種對(duì)白腐菌具有抗性,尤其是刺葡萄0943對(duì)白腐菌具有很強(qiáng)的抗性。本課題前期研究發(fā)現(xiàn),中國(guó)野生種刺葡萄0943對(duì)白腐病抗性很強(qiáng),且發(fā)現(xiàn)Vd WRKY49和Vd WRKY53轉(zhuǎn)錄因子在刺葡萄抗白腐病中具有重要作用。為了進(jìn)一步研究刺葡萄0943抗病品種中與抗性有關(guān)的基因,該試驗(yàn)以美人指為對(duì)照研究VdWRKY70轉(zhuǎn)錄因子的抗病功能。本研究的內(nèi)容和結(jié)論如下:本研究主要取得以下成果:1、通過刺葡萄0943和美人指接白腐菌表型觀察和接菌后不同時(shí)期臺(tái)盼藍(lán)染色觀察,發(fā)現(xiàn)刺葡萄0943抗白腐能力較強(qiáng)。通過分析刺葡萄0943和美人指中SA、JA含量變化與WRKY70相關(guān)抗病基因NPR1、PR1相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì),發(fā)現(xiàn)VdNPR1和VdPR1的變化趨勢(shì)與SA含量變化趨勢(shì)一致,因此推測(cè)Vd WRKY70主要通過SA途徑調(diào)控刺葡萄0943抗白腐病功能。2、通過擬南芥原生質(zhì)體定位和核定位分析發(fā)現(xiàn),VdWRKY70具有核定位信號(hào),定位到擬南芥細(xì)胞核中。3、通過轉(zhuǎn)VdWRKY70擬南芥苗的培養(yǎng),用野生型擬南芥作對(duì)照,同時(shí)接白腐菌、白粉菌和Pst DC3000,通過接菌一定時(shí)間后表型觀察、臺(tái)盼藍(lán)染色、數(shù)量性狀統(tǒng)計(jì)一系列手段,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗病能力均比野生型擬南芥強(qiáng)。將擬南芥接菌后SA含量的變化與Vd WRKY70、At NPR1、AtPR1相對(duì)表達(dá)量的變化分析,進(jìn)一步研究Vd WRKY70在SA途徑中的抗病性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥接不同類型菌后AtNPR1、AtPR1相對(duì)表達(dá)量與SA含量的變化趨勢(shì)基本一致。4、通過聚類分析,發(fā)現(xiàn)VdWRKY70蛋白序列與FcWRKY70,CaWRKY70,AtWRKY70,AtWRKY54以及ClWRKY70聚在一起,表明它們?cè)诠δ苌弦灿幸欢ǖ南嗨菩浴?、用同源克隆的方法獲取刺葡萄0943和美人指的啟動(dòng)子序列,通過序列比對(duì)和順式作用元件分析發(fā)現(xiàn),VdPR1和VvPR1啟動(dòng)子序列具有一定的差異,其中Vd PR1比Vv PR1多26bp,且有SA途徑相關(guān)順式作用元件,因此推測(cè)VdWRKY70轉(zhuǎn)錄因子在SA途徑中可能與VdPR1啟動(dòng)子相結(jié)合發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S436.631
【圖文】：

第 3 章 結(jié)果與分析第 3 章 結(jié)果與分析3.1 葡萄接白腐菌后表型觀察將‘刺葡萄 0943’和美人指用針刺法分別接種白腐菌，并用清水作為對(duì)照。從圖 3-1 可以看出，用針刺法在美人指和‘刺葡萄 0943’傷口處分別用清水處理作為對(duì)照（CK），發(fā)現(xiàn)美人指和‘刺葡萄 0943’的對(duì)照并無出現(xiàn)癥狀。但在接菌 5d 后，美人指接菌處出現(xiàn)明顯的病斑，‘刺葡萄 0943’幾乎沒有病斑的出現(xiàn)，說明‘刺葡萄 0943’的抗白腐病能力要強(qiáng)于美人指。VIM CK VIM 5dpi VAC CK VAC 5dpi

圖 3-1‘刺葡萄 0943’和美人指接白腐菌表型觀察Fig. 3-1 Phenotypic observation of C. diplodilla in VAC and VIM3.2 葡萄接白腐菌臺(tái)盼藍(lán)染色觀察為進(jìn)一步研究‘刺葡萄 0943’的抗白腐病的能力和抗病機(jī)制，將‘刺葡萄 0943’和美人指接白腐菌后各時(shí)期的新鮮葉片進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，觀察各時(shí)期葡萄葉片細(xì)胞被殺死的情況。研究發(fā)現(xiàn)在接菌后 0-24 h，‘刺葡萄 0943’葉片接菌處染色情況比美人指較為嚴(yán)重，之后染色面積擴(kuò)大范圍較小，但美人指在接菌 24 h 后，染色面積明顯增大。說明在接菌 24 h 后‘刺葡萄 0943’細(xì)胞死亡較少，而美人指細(xì)胞死亡數(shù)量明顯要比刺葡萄多。說明‘刺葡萄 0943’的抗白腐病能力比美人指強(qiáng)。0h 24h 48h 72h 96h

圖 3-4 VdWRKY70 及相關(guān)抗病基因表達(dá)量時(shí)熒光定量分析 WRKY70 及 NPR1，PR1 的表達(dá)量。試驗(yàn)進(jìn)行 3 次重復(fù)，SD次生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，小寫字母為 p<0.05 水平上的差異顯著性。Fig. 3-4 Expression of VdWRKY70 and related disease resistance genestive expression levels of WRKY70, NPR1 and PR1 were analyzed using qRT-PCR. he mean±SD from three independent experiments. Statistically significant differenare indicated by lower-case letters (P < 0.05; Student’s t-test).RKY70 的亞細(xì)胞定位WRKY70 轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體，分別從目標(biāo)蛋白熒光通道、Marke綠體熒光通道、明場(chǎng)、疊加圖幾種途徑觀察 VdWRKY70 在擬南芥。紅色標(biāo)識(shí)的箭頭即為 VdWRKY70 定位的位置，從原生質(zhì)體定位dWRKY70 主要定位在擬南芥的細(xì)胞核中。說明 VdWRKY70 主要0h 12h 24h 48h 72h接菌時(shí)間(hpi)

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本文編號(hào)：2783377