【摘要】：近年來,稻曲病的發(fā)生日趨嚴(yán)重且危害面積逐年擴(kuò)大,已成為嚴(yán)重影響黑龍江省水稻產(chǎn)量及品質(zhì)的主要病害之一。但黑龍江省關(guān)于對(duì)稻曲病的基礎(chǔ)研究方面較為薄弱,為了進(jìn)一步明確黑龍江省稻曲病的發(fā)生規(guī)律及遺傳背景分析,本論文研究了黑龍江省水稻稻曲病病原菌的分離方法、生物學(xué)特性、分子檢測(cè)和遺傳多樣性分析,為稻曲病的早期鑒定、科學(xué)防治及抗病育種提供理論參考。本文從黑龍江省5個(gè)水稻主栽區(qū)采集病樣108份,采取3種分離方法對(duì)稻曲病菌進(jìn)行分離率比較,并從各采樣區(qū)分別選取代表菌株進(jìn)行生物學(xué)特性分析,設(shè)計(jì)水稻稻曲病的特異性引物并進(jìn)行檢測(cè),然后利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)成功分離所得的89個(gè)水稻稻曲病菌菌株的遺傳多樣性進(jìn)行研究,分析黑龍江省水稻稻曲病菌的遺傳背景。主要結(jié)果如下:(1)采用改進(jìn)的組織分離法明顯提高了稻曲病菌分離成功率,本方法污染小,分離成功率高,分離率可達(dá)76%,該方法明顯優(yōu)于厚垣孢子懸液分離法和菌核萌發(fā)法,厚垣孢子懸液分離法和菌核萌發(fā)法分離率分別為6.67%和30%。利用上述3種方法成功從黑龍江省5個(gè)水稻主栽區(qū)采集病樣成功分離得到個(gè)89個(gè)稻曲病菌菌株。(2)試驗(yàn)測(cè)得分離得到的稻曲病菌菌株的平均生長(zhǎng)速率為0.1875cm/d。其中,所有菌株中,生長(zhǎng)速率大于平均生長(zhǎng)速率的菌株有15株,占所有代表菌株的60%,主要來自于哈爾濱、牡丹江和綏化地區(qū)的菌株;生長(zhǎng)速率小于平均生長(zhǎng)速率的菌株有10株,占所有代表菌株的40%,主要來自于佳木斯及齊齊哈爾地區(qū)的菌株。哈爾濱地區(qū)及牡丹江、綏化地區(qū)菌株的生長(zhǎng)速率大于齊齊哈爾地區(qū)及佳木斯地區(qū)菌株的生長(zhǎng)速率。(3)通過對(duì)稻曲病菌培養(yǎng)條件及營(yíng)養(yǎng)需求研究結(jié)果表明:馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)為稻曲病菌生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基,26℃為菌絲生長(zhǎng)的最適溫度,最適pH值為7.0,蔗糖為最適碳源,KNO_3為最適氮源。(4)本文設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物UV-A/UV-B且只對(duì)稻曲病菌擴(kuò)增出長(zhǎng)度為260bp的特異性片段,而其他供試菌株均未擴(kuò)增出目的條帶,可被用于水稻稻曲病菌(U.virens)的檢測(cè);該引物在PCR反應(yīng)中,對(duì)水稻稻曲病菌基因組DNA的檢測(cè)靈敏度為1 pg,從而建立了靈敏度高、特異性好的稻曲病菌PCR檢測(cè)體系。將稻曲病菌接種至水稻穗粒后最早于48 h時(shí),便可檢測(cè)到稻曲病菌。(5)篩選出9對(duì)SSR引物對(duì)分離得到的89個(gè)供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增,每對(duì)引物的擴(kuò)增條帶均在2~7之間,共得到43條譜帶,平均每條引物擴(kuò)增出4.8條譜帶。其中多態(tài)性條帶25條,占總數(shù)的58.1%。引物S318的多態(tài)性最好,多態(tài)性條帶比率達(dá)到85.7%,S509多態(tài)性最差,多態(tài)性條帶比率僅為33.3%。通過SSR分子標(biāo)記分析菌株間遺傳相似系數(shù)顯示,稻曲病菌菌株的GS(遺傳相似系數(shù))為0.613~0.955,平均值為0.741,差值為0.342;其中,佳木斯地區(qū)和齊齊哈爾地區(qū)的稻曲病菌菌株之間的GS最小,為0.613,遺傳距離最遠(yuǎn),遺傳相似程度最低;哈爾濱地區(qū)和牡丹江地區(qū)稻曲病菌菌株間的GS最大,為0.955,遺傳距離最近,遺傳相似程度最高。依據(jù)SSR結(jié)果分析,當(dāng)遺傳距離為0.73時(shí),89個(gè)菌株分為3個(gè)類群,5個(gè)地區(qū)的稻曲病菌菌株在3個(gè)類群里均有分布,哈爾濱地區(qū)的菌株主要分布在第Ⅲ類群中。牡丹江地區(qū)的菌株較均勻地分布在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類群中。佳木斯地區(qū)的菌株主要分布在第Ⅰ、Ⅱ類群中。齊齊哈爾地區(qū)的菌株主要分布在第Ⅱ、Ⅲ類群中。綏化地區(qū)的菌株主要分布在第Ⅰ、Ⅱ類群中。研究結(jié)果表明黑龍江省水稻稻曲病菌遺傳背景復(fù)雜程度較低,菌株整體遺傳較為穩(wěn)定。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.111.4
【圖文】：

圖 3-3 各代表菌株的生長(zhǎng)速率Fig. 3-3 Growth rate of each strain如圖 3-4 所示，25 個(gè)代表菌株的平均生長(zhǎng)速率為 0.1875cm/d。其中 15 個(gè)代表菌株的生長(zhǎng)速率大于平均生長(zhǎng)速率 0.1875cm/d，占所有代表菌株的 60%，主要是采集于哈爾濱地區(qū)及牡丹江地區(qū)、綏化地區(qū)的菌株。其中 10 個(gè)代表菌株的生長(zhǎng)速率小于平均生長(zhǎng)速率0.1875cm/d，占所有代表菌株的 40%，主要是采集于佳木斯及齊齊哈爾的代表菌株。00.050.10.150.20.25HB1HB2HB3HB4HB5MD1MD2MD3MD4MD5SH1SH2SH3SH4SH5JS1JS2JS3JS4JS5QQ1QQ2QQ3QQ4QQ5生長(zhǎng)速率（cm/d）代表菌株

即最大值為 2.13cm 左右，而后隨著溫度升高，菌絲生長(zhǎng)受到抑制，溫度超0℃后所有地區(qū)代表菌株的生長(zhǎng)均受抑制（如圖 3-5，圖 3-6）。在溫度范圍為 25℃至?xí)r，牡丹江、哈爾濱、綏化、佳木斯、齊齊哈爾 5 個(gè)地區(qū)代表菌株平均菌落直徑差為：m，3.15cm，4.05cm，4.25cm，5.4cm，說明綏化、哈爾濱地區(qū)的代表菌株適宜生長(zhǎng)溫圍較寬，而牡丹江及佳木斯、牡丹江地區(qū)的菌株適宜生長(zhǎng)溫度范圍較窄。圖 3-5 不同溫度對(duì)稻曲病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig. 3-5 Effect of different temperatures on mycelial growth of U. virens050505HB1 HB2 MD1 MD2 SH1代表菌株15℃20℃25℃26℃27℃28℃30℃35℃22.515℃20℃25℃26℃

結(jié)果與分析絲均為白色且密度均勻，形態(tài)較為相似；PSA 基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的菌落中央為黃色，逐漸被周圍長(zhǎng)出的白色菌絲包圍，最終呈蓬松且不均勻狀（如圖 3-9）。以 KNO3為氮源的培養(yǎng)基中測(cè)得供試菌株菌落直徑最大值，置于 26℃、30d 培養(yǎng)后的菌落平均直徑在 6.58cm 左右。其次以 L-天冬酰胺為氮源的培養(yǎng)基中所測(cè)得的供試菌株菌落直徑較大，而各菌株在以尿素為氮源的培養(yǎng)基中所測(cè)得的菌落直徑最小，即生長(zhǎng)速度最慢，26℃、30d 培養(yǎng)后各代表菌株的平均菌落直徑在 4.28cm 左右，以 PSA 為對(duì)照的培養(yǎng)基中測(cè)得供試菌株菌落平均直徑在7.35cm 左右（如圖 3-8）。

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