【摘要】：[目的]主要由膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的炭疽病和由灰葡萄孢菌(Boteytis cinerea)引起的灰霉病是草莓生產(chǎn)上兩大主要病害�；瘜W(xué)防治是草莓生產(chǎn)上防治炭疽病、灰霉病兩大病害的主要手段,病原菌群體對藥劑的敏感性是決定防治效果的主要因素之一。傳統(tǒng)的抗藥性檢測方法是將病原菌分離純化后,轉(zhuǎn)接在含藥培養(yǎng)皿上,根據(jù)藥劑對病原菌的生長抑制作用來鑒定是否為抗藥性菌株,該方法工作量大,耗時(shí)長;本研究為了實(shí)現(xiàn)抗藥性快速檢測的目的,建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),在1~2 h內(nèi)得到可靠的抗藥性檢測結(jié)果,能快速檢測和監(jiān)測病原菌的抗藥性發(fā)展,從而合理指導(dǎo)用藥。[方法]針對灰霉病,本研究通過錯配堿基引物特異性鑒定抗藥性菌株、優(yōu)化反應(yīng)組分和條件,從而建立抗藥性LAMP快速檢測體系。最后應(yīng)用LAMP檢測技術(shù)檢測田間樣品,同時(shí)將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng),利用傳統(tǒng)區(qū)分劑量法檢測抗藥性,結(jié)果和LAMP檢測相比較,驗(yàn)證LAMP檢測結(jié)果。針對炭疽病,本研究建立LAMP快速檢測技術(shù)用于草莓苗期炭疽病的檢測;隨后,測定了草莓炭疽病菌的抗藥性,分析其抗性分子機(jī)制,建立了草莓炭疽病菌抗藥性LAMP檢測方法。[結(jié)果]1.開發(fā)了一種環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測體系,設(shè)計(jì)錯配引物,能快速檢測灰葡萄孢菌β-tubulin基因上E198A突變基因型(對苯并咪唑類殺菌劑高抗);灰霉病菌E198A基因型LAMP檢測的最佳反應(yīng)條件為64℃,60 min;本研究中LAMP靈敏度是常規(guī)PCR的10倍。和區(qū)分劑量法的檢測結(jié)果比較表明LAMP檢測田間抗性菌株可達(dá)到100%的準(zhǔn)確性。2.建立了LAMP快速檢測體系,用于田間灰葡萄孢菌對甲氧基丙稀酸酯(QoIs)類殺菌劑的抗性監(jiān)測和抗性發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)評估,其中包含兩個LAMP檢測,其一能準(zhǔn)確檢測到灰霉病菌對Qo I類殺菌劑具有高度抗性的G143A突變體;其二能檢測出灰葡萄孢中cytb基因上BCbi143/144內(nèi)含子。LAMP檢測的最佳反應(yīng)條件為61℃,50 min,使用ALL-DNA-Fast-Out在10 min內(nèi)對田間樣品進(jìn)行核提取前處理,以實(shí)現(xiàn)一步法快速檢測�？傊�,本研究建立了一個快速靈敏的LAMP測定系統(tǒng),用于灰霉病菌對QoIs殺菌劑抗性風(fēng)險(xiǎn)評估和監(jiān)測田間抗藥性。3.開發(fā)了一種直接用于草莓苗期炭疽病檢測的LAMP體系,利用LFD(橫向側(cè)流試紙)及堿性聚乙二醇浸提等方法,快速進(jìn)行田間樣品前處理,實(shí)現(xiàn)田間病害快速檢測。4.分別建立了LAMP快速檢測方法,用于特異性檢測膠孢炭疽菌對QoIs類殺菌劑高抗G143A突變基因型和對苯并咪唑類高抗E198A的突變體,檢測結(jié)果和區(qū)分劑量法一致。[結(jié)論]本文研究結(jié)果初步實(shí)現(xiàn)了田間快速檢測草莓主要抗藥性病害的目的,對草莓生產(chǎn)上調(diào)整用藥策略,提高藥劑防治效果、減少藥劑的使用量具有較大的現(xiàn)實(shí)意義。
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.68
【圖文】：

rakis 等利用 RFLP-PCR 對田間桃褐腐病菌（Monilinia laxa）突變，能特異性檢測苯并咪唑類抗性 E198A 突變基因型[95]。ZioPCR 技術(shù)用于灰葡萄孢菌（B.cinerea）對苯并咪唑類殺菌劑抗性的檢介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-Mediated Isothermal AmplificP）檢測技術(shù)導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是于 2000 年由明、報(bào)道的一種新型、方便快捷、靈敏度極高且廉價(jià)的核酸擴(kuò)增方法[97]，原理是針對標(biāo)靶序列 300bp 內(nèi)的 6 個高度保守區(qū)域（F3c，F(xiàn)2c，F(xiàn)lc，B1，性的設(shè)計(jì) 4 條引物。引物的設(shè)計(jì)是該方法能否成功擴(kuò)增的關(guān)鍵，F(xiàn)IP 是上游 和 F2 區(qū)域組成)，其中 F2 區(qū)域與目的基因 F2c 區(qū)域互補(bǔ)；F3 是上游外引物 F3c 區(qū)域互補(bǔ)；BIP 是下游內(nèi)引物（由 BIc 和 B2 區(qū)域組成），其中 B2 區(qū)B2c 區(qū)域互補(bǔ)；B3 作為下游外引物與目的基因的 B3c 區(qū)域互補(bǔ)（圖 1.1）。

2 檢測草莓灰霉病菌抗苯并咪唑類殺菌劑 E198A 基因型的 LAMP 體系的建立與應(yīng)用有限公司提供。其他試劑盒：ALL-DNA-FAST-Out 裂解液（生工生物）、真菌 DNA 快速試劑盒（生物生工，上海）、質(zhì)粒提取 SanPrep Column Plasmid mini-Preps盒（生工生物，上海）、SanPrep 柱式 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒（生工生物，上海儀器：PCR 擴(kuò)增儀（AB 公司），凝膠成像系統(tǒng)（Tanon），超級恒溫水上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），恒溫加熱器。.1.2 引物設(shè)計(jì)使用在線引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Explore V5（http://primerexplorer.jp/e/v5）灰葡萄孢菌對苯并咪唑類殺菌劑抗性菌株 Cl-3 的 β-tubulin 基因（GeneBankQ790278.1）含有 198 位點(diǎn)突變的序列為模板，設(shè)計(jì)引物（圖 3.1），并在 1引入錯配堿基，對設(shè)計(jì)出的 6 套引物（表 3.1）。引物由上海生工生物公司，用 dd H2O 溶解后分裝，4 ℃保存?zhèn)溆谩?

9MFritrle2成的條管低合, 11; E198A 反MP 反應(yīng)產(chǎn)物Figure 2.2 Detimers. Labelrain (S). Labecinerea withectrophoresis..2 Bst DN為了篩選成本就能達(dá)的濃度梯度條帶，但顏管顏色變化低質(zhì)量終濃合酶（8 U·μ反應(yīng)管中含有物凝膠電泳圖ter mining six1, 3, 5, 7, 9, 1el 2, 4, 6, 8, 1h the E198A m. Lane M reprcolors. TheNA 聚合酶選出最低但能達(dá)到快速檢測度下均能擴(kuò)增顏色變化并不化明顯，由反濃度為 0.16 UL-1）是支有 E198A 基. b: LAMP 反x sets (S1 S611: the templa0, 12: the temmutation (E19resented the De positive sam酶量的優(yōu)化能實(shí)現(xiàn) LAM測目的的體增出條帶，但不顯著，當(dāng)反應(yīng)前紫色μL-1，即在持反應(yīng)進(jìn)行因型灰霉菌株反應(yīng)產(chǎn)物可視6) of loop-meate DNA wasmplate DNA w98A). a: LAMDL2000 DNAmples were po化MP 反應(yīng)的體系。如圖 2但在質(zhì)量濃當(dāng) Bst DNA色變?yōu)樘焖{(lán)色在 25μL LA行的最少酶株 DNA 樣品視化HNB顯色ediated isothes extracted frowas extractedMP product deA marker. b: Hointed out by的聚合酶濃度2.3 所示，B濃度為 0.08聚合酶濃度色。說明體AMP 檢測體酶量。品, 即管 2, 4,色圖; 紅色箭rmal amplificom the carbend from the isoetected on 1%HNB-based vy red arrows度，從而篩Bst DNA 聚U·μL-1時(shí)，度大于 0.08體系中 Bst D體系中 0.5 μ, 6, 8, 10, 12.箭頭代表陽性cation (LAMndazim sensitolates of Botry% agarose gelvisual change篩選出以較低聚合酶在優(yōu)化雖能擴(kuò)增出U·μL-1時(shí)，DNA 聚合?

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