【摘要】：[目的]主要由膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的炭疽病和由灰葡萄孢菌(Boteytis cinerea)引起的灰霉病是草莓生產上兩大主要病害。化學防治是草莓生產上防治炭疽病、灰霉病兩大病害的主要手段,病原菌群體對藥劑的敏感性是決定防治效果的主要因素之一。傳統(tǒng)的抗藥性檢測方法是將病原菌分離純化后,轉接在含藥培養(yǎng)皿上,根據(jù)藥劑對病原菌的生長抑制作用來鑒定是否為抗藥性菌株,該方法工作量大,耗時長;本研究為了實現(xiàn)抗藥性快速檢測的目的,建立環(huán)介導等溫擴增檢測(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),在1~2 h內得到可靠的抗藥性檢測結果,能快速檢測和監(jiān)測病原菌的抗藥性發(fā)展,從而合理指導用藥。[方法]針對灰霉病,本研究通過錯配堿基引物特異性鑒定抗藥性菌株、優(yōu)化反應組分和條件,從而建立抗藥性LAMP快速檢測體系。最后應用LAMP檢測技術檢測田間樣品,同時將樣品帶回實驗室分離培養(yǎng),利用傳統(tǒng)區(qū)分劑量法檢測抗藥性,結果和LAMP檢測相比較,驗證LAMP檢測結果。針對炭疽病,本研究建立LAMP快速檢測技術用于草莓苗期炭疽病的檢測;隨后,測定了草莓炭疽病菌的抗藥性,分析其抗性分子機制,建立了草莓炭疽病菌抗藥性LAMP檢測方法。[結果]1.開發(fā)了一種環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)檢測體系,設計錯配引物,能快速檢測灰葡萄孢菌β-tubulin基因上E198A突變基因型(對苯并咪唑類殺菌劑高抗);灰霉病菌E198A基因型LAMP檢測的最佳反應條件為64℃,60 min;本研究中LAMP靈敏度是常規(guī)PCR的10倍。和區(qū)分劑量法的檢測結果比較表明LAMP檢測田間抗性菌株可達到100%的準確性。2.建立了LAMP快速檢測體系,用于田間灰葡萄孢菌對甲氧基丙稀酸酯(QoIs)類殺菌劑的抗性監(jiān)測和抗性發(fā)展風險評估,其中包含兩個LAMP檢測,其一能準確檢測到灰霉病菌對Qo I類殺菌劑具有高度抗性的G143A突變體;其二能檢測出灰葡萄孢中cytb基因上BCbi143/144內含子。LAMP檢測的最佳反應條件為61℃,50 min,使用ALL-DNA-Fast-Out在10 min內對田間樣品進行核提取前處理,以實現(xiàn)一步法快速檢測。總之,本研究建立了一個快速靈敏的LAMP測定系統(tǒng),用于灰霉病菌對QoIs殺菌劑抗性風險評估和監(jiān)測田間抗藥性。3.開發(fā)了一種直接用于草莓苗期炭疽病檢測的LAMP體系,利用LFD(橫向側流試紙)及堿性聚乙二醇浸提等方法,快速進行田間樣品前處理,實現(xiàn)田間病害快速檢測。4.分別建立了LAMP快速檢測方法,用于特異性檢測膠孢炭疽菌對QoIs類殺菌劑高抗G143A突變基因型和對苯并咪唑類高抗E198A的突變體,檢測結果和區(qū)分劑量法一致。[結論]本文研究結果初步實現(xiàn)了田間快速檢測草莓主要抗藥性病害的目的,對草莓生產上調整用藥策略,提高藥劑防治效果、減少藥劑的使用量具有較大的現(xiàn)實意義。
【學位授予單位】：浙江農林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S436.68
【圖文】：

rakis 等利用 RFLP-PCR 對田間桃褐腐病菌（Monilinia laxa）突變，能特異性檢測苯并咪唑類抗性 E198A 突變基因型[95]。ZioPCR 技術用于灰葡萄孢菌（B.cinerea）對苯并咪唑類殺菌劑抗性的檢介導等溫擴增（Loop-Mediated Isothermal AmplificP）檢測技術導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是于 2000 年由明、報道的一種新型、方便快捷、靈敏度極高且廉價的核酸擴增方法[97]，原理是針對標靶序列 300bp 內的 6 個高度保守區(qū)域（F3c，F(xiàn)2c，F(xiàn)lc，B1，性的設計 4 條引物。引物的設計是該方法能否成功擴增的關鍵，F(xiàn)IP 是上游 和 F2 區(qū)域組成)，其中 F2 區(qū)域與目的基因 F2c 區(qū)域互補；F3 是上游外引物 F3c 區(qū)域互補；BIP 是下游內引物（由 BIc 和 B2 區(qū)域組成），其中 B2 區(qū)B2c 區(qū)域互補；B3 作為下游外引物與目的基因的 B3c 區(qū)域互補（圖 1.1）。

2 檢測草莓灰霉病菌抗苯并咪唑類殺菌劑 E198A 基因型的 LAMP 體系的建立與應用有限公司提供。其他試劑盒：ALL-DNA-FAST-Out 裂解液（生工生物）、真菌 DNA 快速試劑盒（生物生工，上海）、質粒提取 SanPrep Column Plasmid mini-Preps盒（生工生物，上海）、SanPrep 柱式 PCR 產物純化試劑盒（生工生物，上海儀器：PCR 擴增儀（AB 公司），凝膠成像系統(tǒng)（Tanon），超級恒溫水上海森信實驗儀器有限公司），恒溫加熱器。.1.2 引物設計使用在線引物設計軟件 Primer Explore V5（http://primerexplorer.jp/e/v5）灰葡萄孢菌對苯并咪唑類殺菌劑抗性菌株 Cl-3 的 β-tubulin 基因（GeneBankQ790278.1）含有 198 位點突變的序列為模板，設計引物（圖 3.1），并在 1引入錯配堿基，對設計出的 6 套引物（表 3.1）。引物由上海生工生物公司，用 dd H2O 溶解后分裝，4 ℃保存?zhèn)溆谩?

9MFritrle2成的條管低合, 11; E198A 反MP 反應產物Figure 2.2 Detimers. Labelrain (S). Labecinerea withectrophoresis..2 Bst DN為了篩選成本就能達的濃度梯度條帶，但顏管顏色變化低質量終濃合酶（8 U·μ反應管中含有物凝膠電泳圖ter mining six1, 3, 5, 7, 9, 1el 2, 4, 6, 8, 1h the E198A m. Lane M reprcolors. TheNA 聚合酶選出最低但能達到快速檢測度下均能擴增顏色變化并不化明顯，由反濃度為 0.16 UL-1）是支有 E198A 基. b: LAMP 反x sets (S1 S611: the templa0, 12: the temmutation (E19resented the De positive sam酶量的優(yōu)化能實現(xiàn) LAM測目的的體增出條帶，但不顯著，當反應前紫色μL-1，即在持反應進行因型灰霉菌株反應產物可視6) of loop-meate DNA wasmplate DNA w98A). a: LAMDL2000 DNAmples were po化MP 反應的體系。如圖 2但在質量濃當 Bst DNA色變?yōu)樘焖{色在 25μL LA行的最少酶株 DNA 樣品視化HNB顯色ediated isothes extracted frowas extractedMP product deA marker. b: Hointed out by的聚合酶濃度2.3 所示，B濃度為 0.08聚合酶濃度色。說明體AMP 檢測體酶量。品, 即管 2, 4,色圖; 紅色箭rmal amplificom the carbend from the isoetected on 1%HNB-based vy red arrows度，從而篩Bst DNA 聚U·μL-1時，度大于 0.08體系中 Bst D體系中 0.5 μ, 6, 8, 10, 12.箭頭代表陽性cation (LAMndazim sensitolates of Botry% agarose gelvisual change篩選出以較低聚合酶在優(yōu)化雖能擴增出U·μL-1時，DNA 聚合?

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本文編號：2769168