【摘要】：馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)嚴(yán)重威脅茄科作物的生產(chǎn),揭示PVY與寄主的互作關(guān)系,可為研究其致病機(jī)理及病害防治提供理論依據(jù)。前期研究發(fā)現(xiàn)普通煙(Nicotiana tabacum)編碼的氯離子通道蛋白CLC-Nt1可能與PVY編碼的6K2蛋白互作。本研究旨在通過多種生物化學(xué)與分子生物學(xué)手段,進(jìn)一步揭示CLC-Nt1蛋白在PVY侵染過程中的作用機(jī)理,主要研究結(jié)果如下:(1)通過分段克隆以及無義突變的方法構(gòu)建了PVY壞死株系(Potato virus Y necrosis strain,PVY~N)侵染性克隆PVY-S。該侵染性克隆可侵染本氏煙(Nicotiana benthamiana)、普通煙與番茄,并具有和野生病毒相似的致病力。在該侵染性克隆中分別插入表達(dá)了外源蛋白GFP、Rosea1及MtPsy2a,可直觀監(jiān)測PVY侵染進(jìn)程,為研究PVY的致病機(jī)理提供一個(gè)有利工具。(2)通過病毒介導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)、CRISPR/Cas9技術(shù)、回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)等方法證明CLC-Nt1蛋白參與植株的生長發(fā)育。利用GUS染色進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析,表明CLC-Nt1基因在根、莖、葉及花中均表達(dá)。通過亞細(xì)胞定位分析,發(fā)現(xiàn)CLC-Nt1蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與COP II小泡。利用對(duì)pH敏感的熒光蛋白探針(pHluorin),證明CLC-Nt1蛋白參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pH。利用secreted GFP(secGFP)證明CLC-Nt1蛋白參與胞內(nèi)蛋白分泌途徑。(3)通過酵母雙雜交(Yeast two hybrid)、共定位分析、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)等方法,證明CLC-Nt1蛋白與6K2蛋白互作。利用對(duì)pH敏感的熒光蛋白探針,發(fā)現(xiàn)PVY侵染和單獨(dú)表達(dá)6K2蛋白均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pH升高。通過病毒介導(dǎo)的基因沉默、CRISPR/Cas9技術(shù)、化學(xué)抑制劑等方法,發(fā)現(xiàn)CLC-Nt1蛋白功能缺失后PVY的胞內(nèi)復(fù)制以及系統(tǒng)侵染均受到抑制,表明CLC-Nt1蛋白是PVY侵染所必需的一個(gè)寄主因子。根據(jù)上述結(jié)果得出結(jié)論:PVY侵染普通煙后通過自身編碼的6K2蛋白與普通煙的CLC-Nt1蛋白互作而調(diào)節(jié)CLC-Nt1蛋白功能,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)pH升高,利于PVY募集復(fù)制囊泡組分,從而促進(jìn)病毒胞內(nèi)復(fù)制與系統(tǒng)侵染。本研究首次證明植物的CLC蛋白具有調(diào)節(jié)細(xì)胞器內(nèi)pH的功能,并首次從胞內(nèi)pH的角度分析植物病毒與寄主的互作關(guān)系,為今后作物抗病毒藥物的開發(fā)提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S432.41
【圖文】：

tCLCd（von der Fecht-Bartenbach et al., 2007）及 AtCLCf 蛋白等（Marmagne et a膜片鉗技術(shù)在原位檢測跨膜離子流；而在爪蟾卵母細(xì)胞中異源表達(dá)這些 CLC果并不完全可靠，這些技術(shù)障礙限制了對(duì)此類 CLC 蛋白功能的理解。根據(jù)序AtCLCd 蛋白可能是 Cl-/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而不是 Cl-通道蛋白（Zifarelli & Pusc同哺乳動(dòng)物 CLC-4 及 CLC-5 蛋白一樣參與調(diào)節(jié)細(xì)胞器內(nèi) pH（Hara-Chikuma euma et al., 2005b; Mohammad-Panah et al., 2009）。利用一種可以準(zhǔn)確檢測細(xì)胞料將有助于理解這些 Cl-/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞中的作用。白分泌途徑與細(xì)胞器內(nèi) pH 關(guān)系對(duì)pH敏感的熒光染料，例如：FITC（dextran-conjugated forms of fluorescein isotnn & Kosegarten, 1995）和 Oregon green（Christoph-Martin & Mühling, 2011），胞質(zhì)外體 pH；BCECF（2′,7′-bis-(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxy fluorescein）arboxy seminaphthorhodafluor）被用來測定細(xì)胞質(zhì)和液泡內(nèi)的 pH（Gehring e et al., 1997; Gonugunta et al., 2008; Krebs et al., 2010）。然而這些熒光染料常會(huì)

士學(xué)位論文 ，并且不能特異性地區(qū)分不同細(xì)胞器，因此并不適用于檢測內(nèi)內(nèi) pH。除了熒光染料外，一些遺傳編碼的對(duì) pH 敏感的熒光蛋白內(nèi)細(xì)胞器 pH。Miesenbock 首先鑒定到一個(gè) GFP 突變體（pHlu 和 470nm 兩種波長激光激發(fā)出熒光，并且熒光強(qiáng)度比值隨 pH 變曲線后可根據(jù)光強(qiáng)比值準(zhǔn)確計(jì)算蛋白周圍 pH（Miesenbock et al將 pHlurion 靶向至不同細(xì)胞器，實(shí)現(xiàn)無損傷、高特異性地檢測不ere 利用 pHluorin 檢測了擬南芥和煙草細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)細(xì)胞器內(nèi) pH內(nèi) pH 呈梯度降低趨勢(shì)；其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是 pH 最高也是蛋白分泌途H 最低，如圖 1.2（Martiniere et al., 2013; Shen et al., 2013）。

國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引研究表明蛋白分泌途徑中細(xì)胞器內(nèi)的 pH 對(duì)蛋白分泌的正常進(jìn)行至關(guān)重要，當(dāng)一種或多種器內(nèi) pH 平衡狀態(tài)被打破時(shí)，蛋白質(zhì)的加工與分泌進(jìn)程將受到嚴(yán)重的影響。例如，用 monenmonovalent ion-selective ionophore，一價(jià)離子選擇性離子載體）處理細(xì)胞，會(huì)引起反面高爾形態(tài)變化，破壞細(xì)胞器完整性（Mollenhauer et al., 1990）。進(jìn)一步研究表明，monensin 會(huì)打面高爾基體膜內(nèi)外質(zhì)子梯度（Boss et al., 1984），抑制一些可溶性蛋白，如 phytohemaggluti及一些貯存蛋白前體的膜泡運(yùn)輸（Matsuoka et al., 1990; Gomez & Chrispeels, 1993）。反面高體內(nèi)酸性環(huán)境改變還會(huì)影響可分泌蛋白翻譯后修飾以及加工進(jìn)程（Carnell & Moore, 1994），貨物蛋白的目的地（Chanat & Huttner, 1991）。一些駐留蛋白，例如 TGN38 和 furin 的定Chapman & Munro, 1994），以及一些蛋白水解酶的運(yùn)輸與成熟同樣依賴于細(xì)胞器內(nèi)環(huán)境 Schmidt & Moore, 1995）。

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