【摘要】：禾谷縊管蚜Rhopalosiphum padi(半翅目Hemiptera,蚜科Aphididae)是重要的麥類作物害蟲,也是全球最重要的農(nóng)業(yè)害蟲之一。該蟲不僅刺吸小麥汁液,而且傳播大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV),每年對(duì)全世界范圍內(nèi)的小麥產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前,禾谷縊管蚜的防治主要依靠化學(xué)防治,而擬除蟲菊酯殺蟲劑因其具有廣譜、高效、低殘留等眾多優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在蚜蟲的防治上。殺蟲劑長期大量、不合理的使用已經(jīng)導(dǎo)致禾谷縊管蚜對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性。昆蟲電壓門控的鈉離子通道(Voltage-gated sodium channel,VGSC)是擬除蟲菊酯等殺蟲劑的作用靶標(biāo),鈉通道基因突變是導(dǎo)致昆蟲對(duì)擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性的主要原因。以往研究認(rèn)為真核生物鈉通道基因普遍由1個(gè)基因編碼,而本實(shí)驗(yàn)室近期研究發(fā)現(xiàn)禾谷縊管蚜鈉通道具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu),其由RpNa_vH1和RpNa_vH2兩個(gè)基因編碼。本研究不僅分析了禾谷縊管蚜獨(dú)特鈉通道基因的選擇性剪接的類型以及突變位點(diǎn),還對(duì)禾谷縊管蚜鈉通道輔助亞基的功能進(jìn)行了分析。研究結(jié)果可為深入闡明該蟲鈉通道基因獨(dú)特結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ),并且為以蚜蟲獨(dú)特鈉通道為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥的設(shè)計(jì)與開發(fā)提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1、禾谷縊管蚜鈉通道基因的選擇性剪接類型利用公共數(shù)據(jù)庫中的禾谷縊管蚜基因組數(shù)據(jù),對(duì)禾谷縊管蚜鈉離子通道基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,其中RpNa_vH1基因長度為15058 bp,有22個(gè)內(nèi)含子;RpNa_vH2基因長度為6798 bp,含12個(gè)內(nèi)含子�？寺『坦瓤O管蚜鈉通道基因并進(jìn)行序列比對(duì),在RpNa_vH1基因中共鑒定了3個(gè)可變剪接外顯子,分別命名為rAS1、rAS2、rAS3,其分別對(duì)應(yīng)果蠅鈉離子通道的可選外顯子j、組成型外顯5、可選外顯子b,總共存在5種剪接變體類型。在RpNa_vH2基因中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)可變剪接外顯子,分別命名為rAS4和rAS5,其分別對(duì)應(yīng)果蠅鈉離子通道的組成型外顯子22的一部分、組成型外顯子24,總共存在3種剪接變體類型。2、禾谷縊管蚜鈉離子通道基因突變位點(diǎn)的檢測(cè)本研究通過對(duì)禾谷縊管蚜氯氟氰菊酯抗性品系與敏感品系的鈉離子通道基因編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序比對(duì),在抗性品系中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)新的突變位點(diǎn):V107A、D263G、M284K、E325G以及S531G,其中D263G和M284K這兩個(gè)突變位點(diǎn)位于昆蟲鈉通道上的擬除蟲菊酯PyR2結(jié)合區(qū)域。3、干擾禾谷縊管蚜鈉通道基因?qū)ζ漭o助亞基基因表達(dá)的影響根據(jù)RNAi及RT-qPCR結(jié)果表明,干擾禾谷縊管蚜鈉通道RpNa_vH1基因后,RpTEH1、RpTEH2、RpTEH4以及RpTipE這四個(gè)基因的表達(dá)水平顯著降低,但對(duì)輔助亞基RpTEH3基因的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響;干擾禾谷縊管蚜鈉通道RpNa_vH2基因后,RpTEH1、RpTEH2、RpTEH3、RpTEH4和RpTipE基因的表達(dá)水平都顯著降低。4、禾谷縊管蚜輔助亞基RpTipE在調(diào)節(jié)昆蟲鈉離子通道門控中的作用干擾禾谷縊管蚜輔助亞基RpTipE基因后導(dǎo)致鈉通道基因RpNa_vH1、RpNa_vH2和輔助亞基RpTEH1、RpTEH2、RpTEH3以及RpTEH4基因的表達(dá)水平都顯著降低。用LC_(50)氯氟氰菊酯處理禾谷縊管蚜?xí)r,注射dsTipE的禾谷縊管蚜死亡率顯著低于對(duì)照組(注射dsGFP以及未注射)的死亡率,表明RpTipE基因的干擾顯著降低了禾谷縊管蚜對(duì)氯氟氰菊酯的敏感性。5、禾谷縊管蚜輔助亞基在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的功能驗(yàn)證電生理實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)DmNa_v22的cRNA單獨(dú)注射到非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)時(shí)只能檢測(cè)到很小的鈉電流,但將DmNa_v22的cRNA分別與DmTipE、RpTEH2、RpTEH3、RpTEH4和RpTipE的cRNA等物質(zhì)量混合注射到非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行共表達(dá),檢測(cè)到了更大的鈉電流,表明RpTEH2、RpTEH3、RpTEH4、RpTipE以及DmTipE均提高DmNa_v22的鈉電流并且縮短DmNa_v22表達(dá)所需時(shí)間。6、禾谷縊管蚜鈉通道在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的功能驗(yàn)證本文還對(duì)禾谷縊管蚜鈉通道的體外表達(dá)進(jìn)行了初步探索,將禾谷縊管蚜鈉通道cRNA單獨(dú)或分別與DmTipE、RpTipE的cRNA等物質(zhì)量混合注射到非洲爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá),結(jié)果均未產(chǎn)生任何鈉電流。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.122.2
【圖文】：

圖 1-1 電壓門控鈉離子通道的門控過程及擬除蟲菊酯類對(duì)動(dòng)作電位影響示意圖（Dong et al. 2014）Fig.1-1 Gating process of voltage-gated sodium channel and the effect of pyrethroids on action potential(Dong et al. 2014)鈉離子不能自由通過神經(jīng)細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，其跨細(xì)胞膜運(yùn)輸必須依靠鈉離子通道。如圖 1-1（a），鈉通道的打開和關(guān)閉是由激活和失活這兩個(gè)門控過程調(diào)節(jié)。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，鈉通道處于完全關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)神經(jīng)元的膜去極化時(shí)，鈉通道被激活（通道打開），鈉離子通過激活鈉通道內(nèi)流，使膜進(jìn)一步去極化，導(dǎo)致動(dòng)作電位不斷上升。鈉通道被激活幾毫秒后，鈉通道會(huì)迅速失活，失活過程不僅是使得動(dòng)作電位下降，還在動(dòng)作電位的終止中起重要作用。復(fù)極化后，鈉通道從失活中恢復(fù)且激活門會(huì)關(guān)閉。失活和從失活中恢復(fù)使得鈉通道完成了從失活狀態(tài)到靜息狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，這保證了細(xì)胞膜恢復(fù)靜息狀態(tài)并準(zhǔn)備下一個(gè)動(dòng)作電位產(chǎn)生。因此，鈉通道在神經(jīng)細(xì)胞以及興奮細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。此外，為了響應(yīng)長時(shí)間的去極化（數(shù)秒至數(shù)分鐘），鈉通道會(huì)逐漸進(jìn)入更穩(wěn)定的緩慢失活的狀態(tài)，該過程被稱為慢失活。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥能夠延長昆蟲鈉通道的開放時(shí)間，影響鈉通道的快速失活，干擾神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳導(dǎo)（圖 1-1（b）藍(lán)色曲線），從而導(dǎo)致昆蟲中毒死亡（Dong et al. 2014）。

圖 1-2 真核生物電壓門控鈉離子通道結(jié)構(gòu)（Catterall 2012; Dong et al. 2014）Fig.1-2 The structure of voltage-gate sodium channel of eukaryotic (Catterall 2012; Dong et al. 2014)脊椎動(dòng)物鈉通道由一個(gè) α 亞基和多個(gè)附屬的 β 亞基組成（圖 1-2）（Yu and Catterall2003）；α 亞基是功能實(shí)體，因此，一般提到的鈉通道基因即指 α 亞基的編碼基因（Catterall 2012）；β 亞基為功能輔助性亞基，在調(diào)節(jié)鈉通道的功能中有輔助作用。β亞基通過非共價(jià)鍵或二硫鍵與 α 亞基相連（Brackenbury and Isom 2011）。哺乳動(dòng)物的電壓門控鈉離子通道有 9 種亞型（Nav1.1-Nav1.9），分別由 9 個(gè)不同基因編碼（Goldin et al. 2002; Catterall et al. 2003）。以往的研究認(rèn)為，昆蟲體內(nèi)只有一個(gè)電壓門控鈉離子通道，其結(jié)構(gòu)和脊椎動(dòng)物鈉通道相似，也是由 1 個(gè)基因編碼（Dong et al.2014）；昆蟲沒有鈉通道的 β 亞基，但在黑腹果蠅 Drosophila melanogaster 等昆蟲中發(fā)現(xiàn)了與脊椎動(dòng)物 β 亞基功能相似的 TipE 和 TEH1-TEH4 輔助亞基（Wang et al. 2013）。將 TipE 作為 β 亞基替代品與 α 亞基共表達(dá)，結(jié)果明確顯示 TipE 能代替 β 亞基起輔助蛋白作用（Feng et al. 1995; Warmke et al. 1997; Lee et al. 2000; Du et al. 2013）。TipE 蛋白和 TEH 蛋白不僅在結(jié)構(gòu)組成上相同，還在輔助功能上相似，但在調(diào)控鈉離子通道上

類真核生物鈉通道、禾谷縊管蚜等蚜蟲的鈉通道的結(jié)構(gòu)圖及其離子選擇酸比對(duì)（Catterall 2012; Dong et al. 2014; Zuo et al. 2016a; Jiang et al. 20ructure of sodium channel of non-aphid eukaryotic or aphids such as R. pad acid of ion selective filter of sodium channel (Catterall 2012; Dong et al. 22016; Jiang et al. 2017)研究認(rèn)為，昆蟲只存在一個(gè)編碼鈉通道的基因，但近年來研究個(gè)基因編碼（Amey et al. 2015; Zuo et al. 2016; Jiang et al. 2017

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