【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼小分子RNA,在植物響應(yīng)病原菌入侵過程中起著重要作用。miR319作為發(fā)現(xiàn)最早的植物miRNA之一,其功能研究集中于植物葉和花的生長發(fā)育,在植物抗病響應(yīng)機制方面的研究鮮見報道。本研究以陸地棉新的miRNA(ghr-miR319)為試驗對象,其在陸地棉響應(yīng)大麗輪枝菌入侵過程中表達水平上調(diào),利用分子生物學(xué)和生物化學(xué)等方法研究其在陸地棉抗病響應(yīng)過程中的分子機制。首先為鑒定棉花miRNA表達豐度建立了一套檢測技術(shù),通過分析棉花3個miRNA的表達譜來評析該技術(shù)體系的特性,優(yōu)化了Stem-loop RT-PCR方法。研究設(shè)計了莖環(huán)特異性反轉(zhuǎn)錄、正向和通用反向3條引物,并梯度稀釋cDNA和RNA,分析這些引物的擴增效率和檢測靈敏度。結(jié)果表明,優(yōu)化的Stem-loop RT-PCR方法具有較高的擴增效率和檢測靈敏度,miR156和miR159擴增效率分別為102%和103.6%;總RNA檢測靈敏度差異較大,分別為20 ng和2 pg。同時,成功地分析了miR156、miR159和miR5658在棉花根莖葉中的表達量。棉花miRNA表達豐度檢測技術(shù)的建立為其miRNA相關(guān)研究提供了技術(shù)保證。接著,在棉花sRNA(small RNA)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和降解組學(xué)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)中鑒定了ghr-miR319和其靶基因GhMYB33,通過生物信息方法分析了兩者相互作用的靶點和剪切位點。并利用Stem-loop RT-PCR和RT-qPCR方法分別檢測了ghr-miR319及其靶基因GhMYB33在接種大麗輪枝菌第10天的相對表達水平,結(jié)果表明,它們分別為上調(diào)和下調(diào)表達,呈相反趨勢。然后,利用VIGS技術(shù)分析ghr-miR319及其靶基因GhMYB33的抗性功能,培育了過表達和沉默ghr-miR319棉花植株,同時,也培育了沉默GhMYB33和GhSPL9基因植株;在對這些過表達和沉默植株接種大麗輪枝菌V991處理,分析它們的抗病性和抗病機制。結(jié)果表明,過表達ghr-miR319以及沉默GhMYB33和GhSPL9基因會促進陸地棉花青素積累,并且可以提高陸地棉對大麗輪枝菌的抗性;然而,沉默ghr-miR319則會抑制陸地棉對大麗輪枝菌的抗性,且陸地棉的花青素含量下降;進而,明確了植株的花青素含量與陸地棉抗病性的相關(guān)性�？傊�,這些研究結(jié)果表明miR319-MYB33-SPL9-DFR途徑參與棉花對大麗輪枝菌的抗性響應(yīng)。本研究工作為全面解析棉花miRNA抗黃萎病菌的分子機制和揭示植物先天免疫機理積累了科學(xué)數(shù)據(jù);同時,也為從miRNA角度探討棉花黃萎病可能的防治措施提供新的思路和途徑。
【學(xué)位授予單位】：吉首大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.621.2
【圖文】：

圖 2.1 Stem-loop RT-PCR 檢測 miRNA 示意圖. 2.1 Schematic showing Stem-loop RT-PCR miRNA a表 2.1 miRNA 引物和序列Table 2.1 The miRNA sequences and primers序列 CGGCGGTGACAGAAGAGAGT-3'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGCTC-3'CCGCGCTTTGGATTGAAGGGA-3'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGAGC-3'CCGCGCATGATGATGATGATG-3'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCATCAT-3'GCACTTTATTGGTCCATCATCC-3'GACACCTGGCTCTTTTTGATTC-3'GTGCAGGGTCCGAGGT-3'

2.2 棉花總 RNA 瓊脂糖凝膠電泳arose gel electrophoresis photo of co注：R：根，S：莖，L：葉Note: R: root, S: stem, L: leafRT-PCR 在棉花中應(yīng)用，必須先性反轉(zhuǎn)錄引物將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成qPCR。對獲得的 Ct 值和稀釋梯 擴增的 Ct 值和稀釋梯度成顯的斜率分別為 SmiR156= 3.27 和R 擴增效率分別為 102%和 10范圍內(nèi)引物擴增效率高。此外峰，無雜峰，進一步證明了引莖環(huán)特異性反轉(zhuǎn)錄引物、正向R 檢測分析，能準確地反映模板

圖 2.2 棉花總 RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖. 2.2 Agarose gel electrophoresis photo of cotton total 注：R：根，S：莖，L：葉Note: R: root, S: stem, L: leaf率檢驗m-loop RT-PCR 在棉花中應(yīng)用，必須先對設(shè)計環(huán)特異性反轉(zhuǎn)錄引物將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA行 RT-qPCR。對獲得的 Ct 值和稀釋梯度進行 miR159 擴增的 Ct 值和稀釋梯度成顯著正相回歸方程的斜率分別為 SmiR156= 3.27 和 SmiR1569 的 PCR 擴增效率分別為 102%和 103.6%。結(jié)拷貝數(shù)范圍內(nèi)引物擴增效率高。此外，RT-q出現(xiàn)單一峰，無雜峰，進一步證明了引物具有究設(shè)計的莖環(huán)特異性反轉(zhuǎn)錄引物、正向引物、A 的 PCR 檢測分析，能準確地反映模板中 miR

【參考文獻】

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本文編號：2752089