【摘要】：植物分泌次生代謝產(chǎn)物作為防御物質(zhì),抵御微生物、昆蟲(chóng)以及動(dòng)物等侵害。植物病原菌在長(zhǎng)期侵染植物的同時(shí),逐漸進(jìn)化出了相應(yīng)的機(jī)制來(lái)解除次生代謝產(chǎn)物的毒性,這使得植物與病原菌間的互作過(guò)程錯(cuò)綜復(fù)雜。人參皂苷是人參分泌的一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物,但未能抵御某些人參病原菌的入侵。其中,人參銹腐病是人參種植區(qū)分布較廣,并且發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)的一種病害。本文以人參皂苷和人參銹腐病菌為研究對(duì)象,探討兩者間的相互作用及作用機(jī)制。研究菌種的選擇:對(duì)四株從不同種植區(qū)病參上分離得到的人參銹腐病菌進(jìn)行菌種鑒定和比較,發(fā)現(xiàn)四株真菌均為柱孢屬真菌,但不屬于同一個(gè)種。選用人參根總皂苷中含量最高的Rb1作為反應(yīng)底物檢測(cè)四株真菌轉(zhuǎn)化皂苷的能力,發(fā)現(xiàn)四株真菌都能夠轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1,但代謝途徑不同。菌種sp.1和sp.3的代謝路徑為Rb1→G-XVII→F2,但菌種sp.3酶解出的G-XVII量極少;菌種sp.2和sp.4除了能水解出G-XVII外,還能夠代謝出少量的Rd,代謝路徑為Rb1→G-XVII/Rd→F2。植物病原菌通過(guò)分泌糖苷酶降解皂苷的毒性,菌種sp.1酶解Rb1時(shí)只生成一種中間產(chǎn)物G-XVII,且代謝出的G-XVII量最多,推測(cè)其分泌的胞外糖苷酶活力相對(duì)較高,有利于通過(guò)分離純化獲得單一的糖苷酶,因此選用菌種sp.1作為后續(xù)的研究對(duì)象。經(jīng)鑒定,菌種sp.1為毀滅柱孢菌。通過(guò)研究毀滅柱孢菌的糖苷酶探討皂苷的酶促降解與毀滅柱孢菌致病性的關(guān)系。用超濾、硫酸銨沉淀、陰離子吸附層析和分子篩層析等方法分離毀滅柱孢菌發(fā)酵液中的糖苷酶,結(jié)果發(fā)現(xiàn)毀滅柱孢菌分泌的糖苷酶行使β-1,2-葡萄糖苷酶活性時(shí)需要輔酶的參與,在輔酶存在的情況下Rb1的酶解產(chǎn)物為G-XVII。由于無(wú)法通過(guò)分離得到毀滅柱孢菌中能夠酶解皂苷的全酶,因此從天然皂苷及其酶解產(chǎn)物對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響來(lái)研究糖苷酶在毀滅柱孢菌侵染人參時(shí)發(fā)揮的作用。用瓊脂稀釋法測(cè)定一株人參病原菌(毀滅柱孢菌)和四株非人參病原菌(玉米穗腐病菌、玉米大斑病菌、大豆疫霉根腐病菌和水稻稻瘟病菌)對(duì)人參根總皂苷、根皂苷中含量最高的六種單體皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1)及其代謝產(chǎn)物的敏感性。對(duì)毀滅柱孢菌來(lái)說(shuō),人參根總皂苷、二醇型皂苷單體Rb1和Rb2能夠明顯地刺激菌絲的生長(zhǎng),但他們的代謝產(chǎn)物卻對(duì)菌絲的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用。三醇型皂苷單體能夠微弱地抑制毀滅柱孢菌的生長(zhǎng)。但天然皂苷和皂苷的酶解產(chǎn)物都能抑制非人參病原菌的生長(zhǎng),且酶解產(chǎn)物的抑制能力更強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),無(wú)論是人參病原菌還是非人參病原菌都能夠分泌降解二醇型皂苷的胞外糖苷酶。以上的結(jié)果都能說(shuō)明毀滅柱孢菌對(duì)皂苷的酶解能力與致病性無(wú)關(guān)。以膜甾醇為靶點(diǎn)研究毀滅柱孢菌是否由于缺乏甾醇導(dǎo)致皂苷無(wú)法插入其細(xì)胞膜使細(xì)胞破裂。經(jīng)鑒定,毀滅柱孢菌的細(xì)胞膜上主要含有四種甾醇,其中麥角甾醇的含量最高。這表明,毀滅柱孢菌并非由于缺乏膜甾醇使皂苷無(wú)法表現(xiàn)出抑菌活性。分別用麥角甾醇構(gòu)建脂質(zhì)體、用毀滅柱孢菌的脂質(zhì)構(gòu)建模擬細(xì)胞膜并制備毀滅柱孢菌的原生質(zhì)體,從不同層面研究皂苷與毀滅柱孢菌膜甾醇的相互作用。皂苷對(duì)脂質(zhì)體和模擬細(xì)胞膜的作用基本相同,人參二醇型皂苷Rb1可以與甾醇形成復(fù)合物破壞脂質(zhì)體和模擬細(xì)胞膜的完整性,而三醇型皂苷Re不能與甾醇結(jié)合。對(duì)原生質(zhì)體而言,雖然人參根總皂苷和單體皂苷都能夠破壞毀滅柱孢菌的原生質(zhì)體,但不同皂苷對(duì)原生質(zhì)體的作用趨勢(shì)并不相同,隨著皂苷濃度的增加,人參根總皂苷和二醇型皂苷Rb1對(duì)原生質(zhì)體的毒害作用逐漸減弱,但三醇型皂苷Re、Rg1以及Rb1的代謝產(chǎn)物G-XVII和F2對(duì)原生質(zhì)體的毒害作用卻明顯增加。這種作用趨勢(shì)與皂苷對(duì)毀滅柱孢菌菌落生長(zhǎng)的作用趨勢(shì)一致。人參皂苷對(duì)原生質(zhì)體的作用與對(duì)膜甾醇的作用并不相同,推測(cè)毀滅柱孢菌細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)還存在其他能夠識(shí)別皂苷并與皂苷作用的物質(zhì)。通過(guò)對(duì)毀滅柱孢菌進(jìn)行全基因測(cè)序,從基因組水平篩選可能識(shí)別皂苷的物質(zhì)。毀滅柱孢菌基因組的大小為60.4 M,GC含量為51.8%。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè),獲得了可能識(shí)別皂苷的2095個(gè)跨膜蛋白、455個(gè)典型分泌蛋白、3403個(gè)非經(jīng)典分泌蛋白和170個(gè)毒性效應(yīng)因子,為后續(xù)深入研究毀滅柱孢菌與人參的互作網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S435.675
【圖文】：

原菌互作時(shí)則會(huì)啟動(dòng)水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑[11]。1.1.2 植物與病原真菌的互作模型在植物與病原菌長(zhǎng)時(shí)間共同進(jìn)化的過(guò)程中，形成了非常復(fù)雜的互作機(jī)制，多植物和病原菌互作的模型先后被提出。1947 年，F(xiàn)lor 通過(guò)研究亞麻和亞麻銹菌小種的特異抗性，提出了基因?qū)僬f(shuō)（Gene-for-Gene Hypothesis）。寄主植物含感病基因（r）和抗病基因（R），時(shí)病原菌含毒性基因（Vir）和無(wú)毒基因（avr）。只有當(dāng)含抗病基因的寄主與無(wú)毒基因的病原菌互相作用時(shí)，寄主才能表現(xiàn)出抗病性，其他的情況都能使寄感�。▓D 1-1）[12,13]。此假說(shuō)已經(jīng)在幾十種不同的植物與其病原菌的關(guān)系中被實(shí)。

1-2 植物抗病性識(shí)別與表達(dá)的受體-配體模型[ Receptor-ligand model for the recognition and exof plant disease resistance[15]

3的警戒假說(shuō)[16]。紅色：“警衛(wèi)”分子，灰色：植R，藍(lán)色：靶蛋白，橘色：疾病 III 型效應(yīng)因子rd hypothesis for R-protein function[16]. Red: guaB-LRR, blue: target protein, orange: type 3 effectnes 和 Dangl 提出了鋸齒模型（Zigzag Model）程可以分為四個(gè)階段：首先，植物通過(guò)病原菌tors, PRRs）感知微生物相關(guān)分子模式或病原ated molecular patterns, MAMPs; pathogen-as，觸發(fā) PAMPs 引起的免疫反應(yīng)（PAMP-triggere

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2749870