【摘要】：花生瘡痂病(Elsino?arachidis)是我國花生主產(chǎn)區(qū)的重要的真菌病害。近年來,發(fā)生普遍,危害嚴重,現(xiàn)已成為花生產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展中亟待解決的植保問題。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),該病菌能夠產(chǎn)生一種橘紅色、具有光敏活性的傒醌類真菌毒素,經(jīng)鑒定為痂囊腔菌素(Elsinochrome,ESC)。傒醌類毒素影響寄主植物的代謝過程,在Alternaria,Cercospora和Elsino?等多種重要病原真菌侵染過程中作為重要的致病因子和毒力因子發(fā)揮作用。探究植物病原真菌毒素在病原菌致病過程中的作用及方式、生物合成途徑及其調(diào)控機制,對于揭示病原菌侵染途徑、致病機制和互作機理具有重要意義。由于國內(nèi)外尚缺乏花生瘡痂病菌的全基因組信息和分子研究體系,病菌致病因子、毒力相關次生代謝、ESC毒素生物合成途徑、調(diào)控網(wǎng)絡尚不明確,病菌侵染和致病、變異和進化、寄主與病原互作分子機制研究尚屬空白,無法為抗病育種和防控策略創(chuàng)新提供理論基礎。本文通過對花生瘡痂病菌光生物學分析,并通過對全基因組序列分析及毒素合成相關基因簇的挖掘,初步預測毒素的生物合成途徑調(diào)控基因,為花生瘡痂病菌致病機制的研究及毒素的生物合成機理提供理論基礎。1.明確了花生瘡痂病菌光生物學光對真菌生長發(fā)育及次生代謝具有重要調(diào)控作用。通過系統(tǒng)研究光質(zhì)、光強和光周期對E.arachidis(LN-JH-C01、LN-SY-A01和LN-FT-H01)菌落形態(tài)、生長發(fā)育及毒素含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),光參與病菌生長發(fā)育及次生代謝。光強度0~20μEm~(-2)s~(-1)為菌株生長最適范圍,30d菌落直徑可達20.07~23.83mm,光強大于100μEm~(-2)s~(-1)時,生長速率減小,菌落直徑僅為11.67~19.00mm;藍光培養(yǎng)條件下,菌落直徑最大,30d可達21.03~23.00mm,紅光和綠光處理下,僅為15.27~18.13mm;不同光周期處理對菌落生長無顯著差異。產(chǎn)毒最適光強為100μEm~(-2)s~(-1),30d產(chǎn)毒量為31.63~82.31 nmol plug~(-1),光強為200μEm~(-2)s~(-1)時,產(chǎn)毒量顯著降低,僅為4.04~10.35 nmol plug~(-1);藍光處理毒素含量增加,3株菌株分別為79.00 nmol plug~(-1),27.68nmol plug~(-1)和87.10 nmol plug~(-1),紅光和黑暗條件下,未檢測到毒素。研究表明,光參與花生瘡痂病菌毒素的生物合成,但Elsino?種間影響效應明顯不同,供試菌株中E.ampelina受光強、光質(zhì)和光周期變化影響相對較小。2.探究了花生瘡痂病菌毒素組分及其生物活性花生瘡痂病菌毒素經(jīng)分離純化,得到R_f值為分別為0.025,0.05,0.18,0.4和0.5的五種不同組分,全波長光譜掃描發(fā)現(xiàn),五種組分的紫外吸收峰存在明顯差異,其中組分1和組分2的紫外吸收峰分別位于460nm和516nm,其它3種組分與粗毒素的紫外吸收峰位點相同,分別在460nm,516nm和560nm。生物活性測定發(fā)現(xiàn),各組分均可引起幼嫩花生葉片(15d)產(chǎn)生壞死斑,其中組分2所引致的壞死面積最大,但接種成熟葉片(45d)后,只有組分2和組分3可引致壞死斑。接種毒素后葉片活性氧清除酶CAT、POD和SOD動態(tài)變化測定結(jié)果表明,組分2和組分3接種后,酶活性均呈先上升后下降的趨勢,且組分2和組分3接種后葉片的電導率隨接種時間增加而升高,96h達最大值,分別為82.95%和78.37%。電導率變化是監(jiān)測細胞膜完整性的指標,研究證明了毒素導致寄主細胞膜系統(tǒng)損傷,致使細胞死亡的主要原因之一,明確了花生瘡痂病菌毒素在致病過程中的生理機制。3.首次揭示了花生瘡痂病菌全基因組生物信息學信息花生瘡痂病菌全基因組序列測序經(jīng)拼接、組裝和注釋后,獲得6.28 Gb的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù),基因組總長約為33.18 Mb,GC含量為48.24%�；蚪M包含9174個蛋白編碼基因,其中編碼分泌蛋白的基因比例為8.0%(734個分泌蛋白),轉(zhuǎn)運蛋白相關基因(TCDB)124個,含有信號肽的蛋白編碼基因949個,跨膜蛋白編碼基因1,829個,以及127個非編碼RNA和13個假基因。通過基因組功能注釋分析,共有8644個蛋白編碼基因被注釋得到(94.22%),其中GO,KEGG以及KOG分析分別注釋到3237個、3055個和4958個基因,分別占基因總數(shù)的35.28%、33.30%和54.04%。基因功能注釋結(jié)果中占比較高的為翻譯后轉(zhuǎn)運和分子伴侶,信號轉(zhuǎn)導機制,碳水化合物的轉(zhuǎn)運和代謝,氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝以及次生代謝產(chǎn)物的生物合成轉(zhuǎn)運及代謝。此外還注釋到與病原菌自身解毒作用相關基因和抗氧化活性功能基因�；蚪M與PHI數(shù)據(jù)庫對比得到2,752個基因,約占30.0%,其中包括次生代謝合成關鍵基因,細胞色素P450,轉(zhuǎn)運蛋白等相關基因。通過分子數(shù)據(jù)分析獲得CAZy(602個)、細胞色素P450(79個)以及ABC超家族轉(zhuǎn)運蛋白(57個)和MFS超家族轉(zhuǎn)運蛋白(190個)等基因家族中致病相關基因�；ㄉ忦璨【蚪M信息分析和挖掘為進一步深入探索病菌致病機制和毒素生物合成途徑奠定了可靠的分子數(shù)據(jù)基礎。4.明確了次生代謝相關PKS基因簇功能信息及ESCB1光表達調(diào)控使用antiSMASH2在線工具對E.arachidis的基因組序列中次生代謝基因簇進行分析發(fā)現(xiàn),基因組中含有PKS,NRPS和PKS-NRPS等基因簇在內(nèi)的86條次生代謝基因簇,經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹分析,其中有6個與ESC(EVM0003759,定名為ESCB1),Melanin(EVM0004732、EVM0005880)和T-toxin(EVM0005988、EVM0002563、EVM0006869)生物合成相關的聚酮合酶基因。光暗處理下ESCB1表達量與毒素產(chǎn)生量趨勢相同,光下表達量顯著高于黑暗處理,進一步證明ESCB1是ESC生物合成的關鍵基因,且其合成途徑與光緊密聯(lián)系。ESCB1所在PKS基因簇共含有13個預測基因,主要包括MFS超家族轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因2個(EVM0006582和EVM0006794),細胞色素P450基因1個(EVM0002495),單氧酶編碼基因1個(EVM0001150),甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因2個(EVM0007299和EVM0001135),水解酶編碼基因1個(EVM0008491)及Zinc finger轉(zhuǎn)錄因子1個(EVM0002638)等。基因簇基因功能預測對于ESC毒素生物合成途徑及調(diào)控網(wǎng)絡的研究具有重要意義。
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.652
【圖文】：

異尾孢菌素（Isocercosporin）Cercospora spp.卡弗他丁C (Calphostin C)枝孢素(Cladochrome)弗萊菌素（Phleichrome）Cladosporium cucumerinumCladosporium cladosporioidesCladosporium phlei痂囊腔菌素（Elsinochromes） Elsino species竹紅菌素（Hypocrellins）異竹紅菌素（Isohypocrellin）Hypocrella bambusaeGraphis hematites菌寄生菌素（HypomycinA）竹黃菌素（Shiraiachromes）其他傒醌類Other perylenequinonesHypomyces spp.Shiraia bambusicolaBulgaria inquinans4,9-dihydroxy-3,10-perylenequinone Cercosporin Elsinochromes Phleichrome

沈陽農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文13圖1-2 尾孢菌素生物合成途徑Fig.1-2 Cercosporin biosynthesis pathway（Margaret et al. 2009）近年來在對ESC的研究過程中，發(fā)現(xiàn)除efPKS1基因調(diào)控ESC的合成外，另有其他相關基因參與調(diào)控作用，且控制ESC合成的基因簇尚不明確。傒醌類真菌毒素的生物合成是在多種酶的催化和復雜的基因調(diào)控下完成的，因此明確該毒素生物合成途徑、催化酶系統(tǒng)、代謝機理、調(diào)控網(wǎng)絡仍需要更加深入的研究。1.5 傒醌類真菌毒素的應用及展望卡弗他丁C（Calphostin C）是蛋白激酶C的有效抑制劑，并且也已被用于癌癥治療的研究（Olivo et al. 2007）。Hypocrellins及其相關衍生物已在國內(nèi)被用于藥物研究，并且已對它們在光動力學腫瘤治療中的用途以及它們的抗病毒性質(zhì)進行了廣泛研究。相關的金絲桃素是用作抑郁癥的草藥的圣約翰草（Hypericum perforatum）的組分（Nahrstedtet al. 2010）。盡管金絲桃素作為抗癌劑具有缺陷，但是金絲桃素的衍生物正在被合成并且在光動力學腫瘤治療中被測試（Waser et al. 2007）。在農(nóng)業(yè)應用中

沈陽農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文LN-FT-H01，LN-JH-C01，LN-SY-A01 雖然在菌落形態(tài)上差異明顯，但進化樹分析顯示（圖 2-1A），供試三株病原菌均屬于花生瘡痂病菌。2.2.2 光強對病原菌生長發(fā)育及毒素產(chǎn)生的影響2.2.2.1 光強對病原菌菌落形態(tài)和菌絲生長的影響光強對于花生瘡痂病菌的菌落形態(tài)和生長速率有顯著影響（圖 2-2）。光強度在 5~20μE m-2s-1的變化范圍內(nèi)，花生瘡痂病菌的菌落形態(tài)無明顯差異，氣生菌絲發(fā)達，菌落邊緣有明顯暗紅色暈圈。而光強為 50μE m-2s-1或更高強度的光處理條件下，菌落形態(tài)上更加緊湊致密，LN-FT-H01 和 LN-JH-C01 氣生菌絲著紅色。光強度 0~20μE m-2s-1為花生瘡痂病菌生長最適光強范圍，菌落直徑為 20.67 ~23.83mm。光強大于 50μE m-2s-1，菌落直徑隨光強增大而降低，200μE m-2s-1菌落直徑僅為 11.67~13.13mm。不同種間對于光強的響應差異明顯，E. ampelina 菌落直徑變化較小，并且菌落顏色均呈暗紅色，形態(tài)無明顯變化。而 E. fawcettii 在 0-200 Jm-2s-1光強度處理下與 E. arachidis表現(xiàn)出相似的光適應性。

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本文編號：2749809