發(fā)布時間：2020-07-09 16:28

【摘要】：桑葉為�？浦参锷�(Morus alba L.)的干燥葉,是我國傳統(tǒng)中藥之一,味甘、苦,性寒,歸肝、肺經(jīng),具有疏散風熱,清肺潤燥,清肝明目的功效。桑葉藥用歷史悠久,歷來有經(jīng)霜采收的要求,且中醫(yī)認為霜桑葉品質(zhì)上乘,但現(xiàn)有結果對桑葉經(jīng)霜采收的科學內(nèi)涵尚未完全闡明。課題組前期對桑葉經(jīng)霜前后主要活性成分的動態(tài)變化進行了研究,發(fā)現(xiàn)經(jīng)霜后綠原酸和黃酮醇苷類成分含量升高,已經(jīng)初步探究了經(jīng)霜對黃酮醇苷類成分影響的分子機制,但尚未對經(jīng)霜前后綠原酸成分差異的分子機制進行研究。本論文采用高效液相色譜法研究桑葉不同生長期綠原酸含量動態(tài)變化規(guī)律,選擇綠原酸含量差異顯著的樣本進行轉錄組測序,利用比較轉錄組學技術篩選差異表達基因,分析差異基因表達水平與綠原酸含量的相關性,挖掘與綠原酸生物合成相關的關鍵酶基因,并對其進行克隆及功能分析,為闡明經(jīng)霜前后綠原酸含量差異的分子機制奠定基礎,同時也為研究桑葉綠原酸生物合成途徑提供依據(jù)。主要研究內(nèi)容如下:1.桑葉經(jīng)霜前后綠原酸含量動態(tài)變化研究采用高效液相色譜法對桑葉經(jīng)霜前后綠原酸含量動態(tài)變化進行研究,結果表明,綠原酸含量在7、8月份較低,霜降(10月23日)后含量逐漸升高于11月份達到最大值。綠原酸含量在7月31日為1.35?0.16 mg/g,11月15日達2.43?0.08 mg/g,兩個樣本中的綠原酸含量呈顯著性差異(P0.01),該結果為轉錄組測序桑葉樣本的選擇提供了依據(jù)。2.桑葉經(jīng)霜前后綠原酸生物合成途徑差異表達基因研究采用Illumina HiSeq 2500測序平臺對桑葉綠原酸含量差異顯著(經(jīng)霜前和經(jīng)霜后)的樣本進行轉錄組測序,通過轉錄組注釋結果,并結合KEGG代謝通路分析,共有58條基因與綠原酸的生物合成相關,編碼5種酶,分別為苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、4-香豆酸CoA連接酶(4-Coumarate-CoA ligase,4CL)、肉桂酸4-羥化酶(Cinnamic acid 4-hydroxylase,C4H)、莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶(Hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase,HCT)和香豆酸-3'-羥化酶(Coumaroyl ester 3'-hydroxylase,C3'H)。其中17條為差異表達基因,包括12條上調(diào)表達基因,5條下調(diào)表達基因。分析不同生長期差異基因表達水平與綠原酸含量的相關性,結果表明c34446_g1、c82179_g1、c46108_g1和c31168_g1基因表達水平與綠原酸含量變化呈顯著正相關,這4條基因分別編碼PAL、4CL、HCT和C3'H。推測這4條基因為綠原酸生物合成途徑的關鍵酶基因,經(jīng)霜后氣候溫度的下降可能誘導c34446_g1、c82179_g1、c46108_g1和c31168_g1基因的表達,有利于綠原酸的積累。3.桑葉莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶基因克隆、表達及功能分析從桑葉中克隆得到MaHCT(c46108_g1)基因,GenBank登錄號為MH476577。MaHCT基因的開放閱讀框長度為1320 bp,編碼439個氨基酸。序列同源性分析表明MaHCT蛋白包含�；D移酶家族的保守域HXXXD和DFGWG。構建了重組質(zhì)粒pET-30a(+)/MaHCT,并在大腸桿菌中誘導表達獲得重組蛋白,重組蛋白為部分可溶性蛋白,分子量約為53 kDa。對MaHCT蛋白進行性質(zhì)表征,結果表明反應條件為37℃、pH=7.4時MaHCT酶活力最大;溫度為4℃和25℃時,酶活性殘留大于85%;pH值在6.4-7.4之間時,酶活性殘留大于89%;Fe~(3+)和Zn~(2+)對酶活力起抑制作用,而Cu~(2+)對酶活力具有增強作用。體外酶促反應結果表明,MaHCT蛋白能有效地催化生成對香豆酰莽草酸、對香豆�？鼘幩岷途G原酸。酶動力學常數(shù)結果表明,當對香豆酰CoA作為�；w時,MaHCT對奎寧酸的親和力高于莽草酸,并且對奎寧酸的催化效率高于莽草酸。當奎寧酸作為�；荏w時,MaHCT對對香豆酰CoA的親和力高于咖啡酰CoA,并且對對香豆酰CoA的催化效率約為咖啡酰CoA的32倍。推測MaHCT更傾向于以對香豆酰CoA為�；w,奎寧酸為酰基受體,生成對香豆�？鼘幩帷�4.桑葉香豆酸-3'-羥化酶基因克隆、表達及功能分析從桑葉中克隆得到MaC3'H(c31168_g1)基因,GenBank登錄號為MK738016。MaC3'H基因的開放閱讀框長度為1530bp,編碼509個氨基酸。序列同源性分析表明MaC3'H蛋白屬于p450 super family,包含4個CYP保守結構域:富含脯氨酸的膜鉸鏈PPGP、I螺旋參與氧結合和激活GGXDTT、PERF和半胱氨酸結構域PFGAGRRXCP。構建了重組質(zhì)粒pET-28a(+)/MaC3'H,并在大腸桿菌中誘導表達獲得重組蛋白,最佳誘導條件:IPTG濃度為1 mmol/L,誘導溫度為30℃,誘導時間6 h。重組蛋白為包涵體蛋白,分子量約為58 kDa,進行變性復性后獲得可溶的MaC3'H蛋白。體外酶促反應結果表明,MaC3'H蛋白能有效地催化對香豆酰莽草酸、對香豆�？鼘幩崤cNADPH生成咖啡酰莽草酸和綠原酸,表明MaC3'H具有3'位羥基化作用。但MaHCT不能催化咖啡酰莽草酸生成咖啡酰CoA。因此初步推測了桑葉中綠原酸可能的主要生物合成途徑。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S888.2
【圖文】：

江 蘇 大 學 碩 士 學 位 論 文2.2.3”項下色譜條件對桑葉樣品和綠原酸對照品進行分析，結果如圖 2到較好的分離，且峰形良好。綠原酸標準曲線如圖2.2所示，結果表明在32圍內(nèi)成良好的線性關系，回歸方程為 y=12.149x-49.357（R2=0.9993）。

23按“2.2.3”項下色譜條件對桑葉樣品和綠原酸對照品進行分析，結果如圖 2.1 所示。綠原酸得到較好的分離，且峰形良好。綠原酸標準曲線如圖2.2所示，結果表明在32.19~1030μg/mL 范圍內(nèi)成良好的線性關系，回歸方程為 y=12.149x-49.357（R2=0.9993）。圖 2.1 綠原酸高效液相色譜圖A: 綠原酸對照品; B: 桑葉樣品Figure 2.1 High performance liquid chromatogram of chlorogenic acid.A. Chlorogenic acid references substances; B. Mulberry leaves sample

0.79 0.66 1.43 95.79 0.77 0.66 1.42 98.83 0.75 0.83 1.55 96.82 97.87 0.76 0.83 1.57 97.43 0.78 1.00 1.77 99.94 0.77 1.00 1.75 98.39葉經(jīng)霜前后綠原酸含量動態(tài)變化2016 年 5 月 5 日至 11 月 25 日桑葉中綠原酸含量進行測定，結果如圖 2.35 月份氣溫較低時含量較高，之后隨氣溫升高含量下降，7、8 月份較低， 23 日）后綠原酸含量逐漸升高達最大值隨后緩慢下降。這與 Yan、張魏婉琪一致。7 月 31 日綠原酸含量為 1.35 0.16 mg/g，11 月 15 日達 2.43 0.之間綠原酸含量存在顯著性差異（P<0.01）。

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