【摘要】：水稻矮縮病是我國(guó)水稻生產(chǎn)上重要的病毒病害之一,其病原物為水稻矮縮病毒(Rice dwarf virus,RDV),由介體昆蟲黑尾葉蟬以持久增殖型方式傳播,并可經(jīng)卵傳播。病毒的經(jīng)卵傳播不僅有利于病毒在嚴(yán)寒等不利環(huán)境下的保存,同時(shí)也會(huì)增加子代昆蟲的帶毒比例,加重病害的流行和發(fā)生。病毒在介體昆蟲中的垂直傳播機(jī)制一直以來都是學(xué)科研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究圍繞RDV在其介體昆蟲黑尾葉蟬中的經(jīng)卵傳播機(jī)制,探討介體卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)、共生菌和RDV三者在病毒經(jīng)卵傳播過程中的相互作用,旨在揭示昆蟲因子、內(nèi)共生菌及植物病毒在經(jīng)卵傳播過程中的多元互作關(guān)系。本研究首先明確Sulcia和Nasuia在黑尾葉蟬雌性成蟲中大量增殖,電鏡和共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)Sulcia和Nasuia在入卵過程中首先粘附在黑尾葉蟬卵巢上皮鞘區(qū)域,隨后通過類似膜融合的方式侵入上皮鞘區(qū)域,且在同一個(gè)上皮鞘濾泡細(xì)胞中可同時(shí)觀察到Sulcia和Nasuia;最后Sulcia和Nasuia在上皮鞘中大量積累并逐步入卵,在初級(jí)卵母細(xì)胞中形成一個(gè)“菌球”。該研究結(jié)果明確了黑尾葉蟬中兩種初級(jí)共生菌Sulcia和Nasuia在體內(nèi)的分布、入卵時(shí)間及入卵路徑均一致。已知Sulcia可以攜帶RDV經(jīng)卵傳播,根據(jù)Sulcia和Nasuia垂直傳播路徑一致,推測(cè)Nasuia可能也參與了RDV的經(jīng)卵傳播。隨后通過共聚焦和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)RDV會(huì)伴隨兩種共生菌Sulcia和Nasuia共同入卵,但RDV在兩種共生菌的分布存在差異。RDV主要是粘附在Sulcia外膜上,而RDV則可分布在Nasuia內(nèi)外膜的周質(zhì)空間中,表明RDV同Sulcia和Nasuia的互作機(jī)制可能存在不同。通過酵母雙雜交和GST Pull-down實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)RDV通過次要外殼蛋白P2與Sulcia OMP(Outermembraneprotein)互作粘附在Sulcia外膜上,通過主要外殼蛋白P8與Nasuia孔蛋白(Porin)互作。通過注射Nasuia Porin特異性抗體阻礙RDV與Nasuia的結(jié)合,可以明顯降低RDV的經(jīng)卵傳播效率,但對(duì)Nasuia入卵的效率沒有影響。由此表明RDV可以利用不同的機(jī)制同時(shí)借助Sulcia和Nalcia入卵,說明RDV、Nasuia和Sulcia已經(jīng)進(jìn)化出了復(fù)雜的三者互作方式。Vg是卵巢發(fā)育過程中主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),是雌性昆蟲羽化后特異性誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白。通過免疫熒光觀察表明:在黑尾葉蟬卵巢發(fā)育的早期,主要通過生殖區(qū)滋養(yǎng)細(xì)胞從血腔中攝取Vg,并通過營(yíng)養(yǎng)絲輸送至發(fā)育中的卵母細(xì)胞中。但在初級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)育至絨毛膜發(fā)生期時(shí),我們發(fā)現(xiàn)Vg 一條新的入卵途徑-通過卵巢的上皮鞘區(qū)域輸送入卵。推測(cè)可能是Vg入卵的一個(gè)輔助途徑,有利于卵母細(xì)胞的成熟。有趣的是,Vg通過上皮鞘入卵的途徑與共生菌入卵的途徑非常相似。通過共聚焦和電鏡同時(shí)對(duì)Sulcia、Nasuia和Vg三者入卵的過程進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)Vg上皮鞘區(qū)域輸送入卵的過程中一直和Nasuia共定位,表明Vg入卵僅僅與Nasuia有關(guān)。進(jìn)一步通過酵母雙雜交和GST-Pull down實(shí)驗(yàn)證明Vg與Nasuia Porin存在特異性互作,而與Sulcia不存在互作。并且通過注射Nasuia、Sulcia和Vg抗體抑制Vg和共生菌間的互作,僅注射Nasuia和Vg抗體會(huì)顯著降低Nasuia和Vg在血淋巴中的共定位。根據(jù)日本學(xué)者對(duì)葉蟬共生菌的研究,通過RNA干擾(RNAinterference,RNAi)抑制葉蟬Ncprp基因的表達(dá),可以有效的抑制Nasuia的增殖,而對(duì)Sulcia增殖沒有影響。因此通過dsNcprp特異性抑制Nasuia增殖時(shí)發(fā)現(xiàn)卵巢內(nèi)Vg的含量也顯著降低;同時(shí)利用RNAi抑制Vg受體(Vitellogeninreceptor,VgR)的表達(dá),可以顯著抑制VgR的表達(dá)和減少Vg在卵內(nèi)的含量,但對(duì)Sulcia和Nasuia入卵數(shù)量沒有影響。由此我們推測(cè):Nasuia和Vg在共同入卵過程中是由Nasuia攜帶Vg入卵,而非Vg幫助Nasuia入卵。在此基礎(chǔ)上,我們還對(duì)RDV、Nasuia和Vg在入卵時(shí)的定位情況進(jìn)行了觀察,發(fā)現(xiàn)無論是在卵巢外粘附的血淋巴細(xì)胞還是在卵巢的上皮鞘區(qū)域,RDV、Nasuia和Vg三者都完全共定位,推測(cè)Nasuia可以同時(shí)攜帶RDV和Vg入卵。綜上所述,本研究首次闡明了在黑尾葉蟬中卵黃原蛋白-共生菌-水稻矮縮病毒三者在經(jīng)卵傳播過程中的相互作用關(guān)系,一方面明確了RDV通過兩種外殼蛋白分別與共生菌Sulcia和Nasuia的互作,伴隨共生菌入卵;另一方面發(fā)現(xiàn)了Vg由Nasuia攜帶從上皮鞘入卵的新通道;同時(shí)闡明了RDV、Nasuia和Vg三者相互作用共同入卵的機(jī)制。研究結(jié)果揭示了經(jīng)卵傳播過程中病毒-共生細(xì)菌-Vg間的三者互作關(guān)系,為探索昆蟲體內(nèi)寄主因子、內(nèi)共生菌及植物病毒在經(jīng)卵傳播過程中的多元互作關(guān)系提供了重要的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.111.4
【圖文】：

圖１－１非持久病毒和半持久病毒介體傳播模式圖（Ｊａｍｅｓ邋ｅｔａｌ．，邋２００６）逡逑Ｆｉｇ邋１－１Ａ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌｓ邋ｆｏｒ邋ｎｏｎｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ邋ａｎｄ邋ｓｅｍｉｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ邋ｖｉｒｕｓ逡逑ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ邋（Ｊａｍｅｓ邋ｅｔ邋ａｌ．？邋２００６）逡逑而輔助蛋白在介體傳毒機(jī)制方面又起什么作用＿？邋Ｇｏｖｉｅｒ和Ｋａｉｓｓａｎｉｓ提逡逑提一種橋?qū)W說（Ｂｒｉｄｇｅｔｈｅｏｒｙ），認(rèn)為在介體傳＿過程中ＨＣ－Ｐｒｏ怍為胃一個(gè)雙功能逡逑分子，一個(gè)功能區(qū)與病毒ＣＰ結(jié)合，另一功能ｇ與蚜蟲口器類似受體的部分結(jié)合逡逑（ＫａｓｓａｎｉｓａｎｄＧｏｖｉｅｒ，邋１９７１）。這’假說很快得到了驗(yàn)證，人們?cè)冢乎戮控?cái)蟲傳播逡逑馬鈴薯Ｙ病霉（ＰｏｒａｔｏＷ／ｍｒ，ＰＶＹ）時(shí)發(fā)現(xiàn)：ＰＶＹ的ＨＣ－Ｐｒｏ的Ｎ端“ＫＩＴＣ”逡逑的四個(gè)氨基酸殘基和蚜蟲口器上的受體蛋白互作（Ｂｌａｎｃ邋ｅＭ．／．，邋１９９８）；另一方面逡逑ＨＣ－Ｐｒｏ的Ｃ端的“ＰＴＫ”區(qū)域和ＰＶＹ的ＣＰ的Ｎ端暴露表面的“ＤＡＧ”區(qū)域逡逑（圖邋１－２＞邋有較強(qiáng)的互作（ＢｌａｎｃｅＭ／．，邋１９９７；Ｐｅｎｇｄｏ／．，邋１９９８）。這樣邋ＨＣ－Ｐｒｏ邋蛋白逡逑在蚜蟲傳播ＰＶＹ時(shí)，可以在ＰＶＹ病毒粒體和蚜蟲口器受體蛋白間形成了一個(gè)逡逑■“橋”（Ｐｌｉｓｓｏｎ邋ａｎｄ邋Ｄｒｕｃｋｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ，，２００３）．．。在．研究花椰菜花葉病粵（Ｇｈ，／訴ｏｗｅｒ逡逑ｗｏ施’ｃ邋ＣａＭＶ）時(shí)也發(fā)現(xiàn)ＣａＭＶ的Ｐ２蛋自在蚜蟲傳毒過程申：也是起了類逡逑ＨＣ－Ｐｒｏ。ＣａＭＶＰ２Ｎ＇逡逑

邐ＰＴＫ邐ＤＡＧ逡逑圖１－２馬鈴薯Ｙ病毒屬基因組以及蟲傳相關(guān)蛋白（Ｐｌｉｓｓｏｎｅｆ？／．，２００３）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｇｅｎｅｔｉｃ邋ｍａｐ邋ｆｏｒ邋ｖｉｒｕｓｅｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｇｅｎｕｓ邋Ｐｏｔｙ＼＞ｉｒｕｓ邋ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｉｎｇ邋ｔｈｅ邋ｌｏｃａｔｉｏｎ逡逑ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＨＣ－Ｐｒｏ邋ａｎｄ邋ＣＰ邋ｇｅｎｅｓ邋（Ｐｌｉｓｓｏｎ邋ｅｔ邋ａｌ．ｓ邋２００３邋）逡逑１Ｘ２．持久傳播型植物病毒的蟲傳機(jī)制逡逑持久傳播型病毒的特點(diǎn)是：病毒在進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后，要經(jīng)過一定時(shí)間的循回逡逑期（幾天或者幾個(gè)星期）才能侵染新的寄主，并：且會(huì)在介體昆蟲的整個(gè)生命周期逡逑內(nèi)存在甚Ｓ在嘂皮后仍會(huì)保留＿介體昆蟲體內(nèi)（Ｈｏｇｅｎｈｏｕｔｅｆａ／．，２００８）。＿持久逡逑傳播X湶《荊摯煞治撼鄭迷觶停荊校澹潁螅椋螅簦澹睿翦澹穡潁錚穡幔紓幔簦椋觶邋澹觶椋潁酰螅┖統(tǒng)志茫擼咴鰣義蟸|擢病霉（Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ邋ｎｏｎ－ｐｒｏｐａｇａｔｉｖｅ邋ｖｉｒｕｓ）＜ｓ．這兩種類型的病毒均可在介體．昆蟲逡逑內(nèi)長(zhǎng)期存活，但持久非增殖型病毒不能在介體內(nèi)復(fù)制。此外，部分持久增殖奧病逡逑毒可通過侵染雌蟲的卵母細(xì)胞和卵進(jìn)行經(jīng)卵傳播，直接將病毒傳至后代昆蟲。逡逑持久型傳播病毒在介體體內(nèi)的循環(huán)過程要經(jīng)過：從腸腔侵染消化道４３皮細(xì)胞，逡逑并在突破基底膜后進(jìn)入血淋巴，最后侵染唾液腺，并在昆蟲取食時(shí)隨唾液一起排逡逑：出：：

蛋白ＮＳｍ；邋Ｓ片段的互補(bǔ)鏈ＲＮＡ編碼２８．８邋ｋＤａ外殼蛋白，病毒鏈ＲＮＡ編碼５２．４逡逑出汪非結(jié)構(gòu)蛋＿＿＞＾８。＿痛霉粒體直徑８０－１１0１１１］１，表面有＇—＿：．伣包裹（來自于寄逡逑主植物），膜外層為５邋ｎｍ厚由糖蛋白組成的突起層〈圖１－５）。在對(duì)

本文編號(hào)：2745944