【摘要】：引進(jìn)芬蘭優(yōu)質(zhì)種藍(lán)狐,通過使用人工授精技術(shù)擴(kuò)繁及改良,使我國(guó)藍(lán)狐養(yǎng)殖業(yè)近20多年來得到了快速發(fā)展。目前,藍(lán)狐使用鮮精輸精受孕率超過80%。但由于缺乏相應(yīng)的育種手段,種質(zhì)呈現(xiàn)逐年退化趨勢(shì),不得不重復(fù)引進(jìn)。精液冷凍技術(shù)理論上可以無限期的保存藍(lán)狐精液,實(shí)現(xiàn)精液遠(yuǎn)距離的交流,同時(shí)對(duì)于生產(chǎn)藍(lán)霜狐(銀狐♂×藍(lán)狐♀)具有巨大的應(yīng)用意義。然而,目前藍(lán)狐精液冷凍技術(shù)在世界范圍內(nèi)尚未成熟,因精子凍融后存活率低下,顯著影響母狐的受孕率。為進(jìn)一步了解超低溫冷凍對(duì)藍(lán)狐精子運(yùn)動(dòng)性及內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成的損傷,從而選擇更優(yōu)質(zhì)的冷凍保護(hù)劑和完整的藍(lán)狐精液冷凍工藝系統(tǒng),進(jìn)行了本試驗(yàn)研究。試驗(yàn)(一):試驗(yàn)共分4組,法國(guó)卡蘇精液冷凍稀釋液(Ⅰ)、東林Ⅱ號(hào)—卵黃冷凍稀釋液(Ⅱ)、Tris—卵黃冷凍稀釋液(Ⅲ)及對(duì)照組常溫稀釋液東林Ⅱ號(hào)(Ⅳ)。凍融后檢測(cè)三種冷凍稀釋液冷凍效果,分別使用伊紅—苯胺黑染色法、低滲腫脹法、考馬斯亮藍(lán)染色法檢測(cè)精子存活率、精子質(zhì)膜完整率、精子頂體完整率,同時(shí)檢測(cè)37℃精子的存活時(shí)間及生存指數(shù)并通過與鮮精對(duì)比綜合選定最佳的冷凍稀釋液;試驗(yàn)(二):將原精分為A、B兩組,A組常溫稀釋,B組選用Ⅲ稀釋液分3批分別為B1、B2、B3組對(duì)藍(lán)狐精液冷凍,通過IVOS精子運(yùn)動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)4組精子運(yùn)動(dòng)情況,并通過透射電子顯微鏡觀察A、B,兩組精子內(nèi)部結(jié)構(gòu);試驗(yàn)(三):選取解凍后精子活率高于0.3的精液對(duì)15只母藍(lán)狐進(jìn)行輸精試驗(yàn)。結(jié)果顯示:超低溫冷凍對(duì)藍(lán)狐精子的損傷很大,與Ⅳ組相比,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組精子凍融后存活率平均下降48.3%,精子質(zhì)膜完整率平均下降48%,頂體完整率平均下降37.4%;37℃時(shí)的凍融后精子平均存活時(shí)間(13h)及平均生存指數(shù)(2.25)遠(yuǎn)低于Ⅳ組的存活時(shí)間(37h)和生存指數(shù)(7.85),精子在解凍后由于復(fù)蘇溫度高激發(fā)精子運(yùn)動(dòng),但精子存活時(shí)間較短;在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組中,Ⅲ組精子存活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率均高于Ⅰ、Ⅱ組;三種藍(lán)狐精液冷凍稀釋液對(duì)藍(lán)狐精子保護(hù)的效果依次為:ⅢⅠⅡ;A、B組精子運(yùn)動(dòng)性差異極顯著(P0.01),B組快速運(yùn)動(dòng)的精子平均占25.1%,中速運(yùn)動(dòng)的精子平均占39.8%,慢速運(yùn)動(dòng)的精子占平均4.2%,不運(yùn)動(dòng)的精子平均占30.9%;B1、B2、B3組精子存活率及快速運(yùn)動(dòng)的精子差異顯著(P0.05)。冷凍工藝存在人工操作因素影響,建議使用自動(dòng)冷凍機(jī)冷凍;使用透射電子顯微鏡觀察,B:組損傷最嚴(yán)重的是精子頭部膜結(jié)構(gòu),頂體完整率僅占25%,冷凍對(duì)精子赤道段、頸部、尾部、線粒體及微管損傷較小;雖然藍(lán)狐精液凍融后精子活力達(dá)0.3以上,符合常規(guī)凍精輸精標(biāo)準(zhǔn),但由于藍(lán)狐精子凍融后在37℃條件下精子存活時(shí)間及生存指數(shù)過低,導(dǎo)致試驗(yàn)15只藍(lán)狐只有1只產(chǎn)崽,凍精輸精受孕率只有6.7%。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S865.23
【圖文】：

受地域和時(shí)間限制，加快動(dòng)物品種育成和改良。逡逑精子在超低溫下，其代謝幾乎停滯，當(dāng)溫度回升復(fù)蘇后恢復(fù)活力且具有受精能力。逡逑但在此過程中會(huì)有大量的精子受到損傷而失去活力。冷凍對(duì)精子損傷如圖１－１所示。造逡逑成精子損傷失活主要有兩個(gè)理論［１８１。①冰晶機(jī)械損傷理論：精液在溫度急劇下降時(shí)由液逡逑態(tài)變成固態(tài)，水分子在降溫過程中形成冰晶，體積不斷增大并移動(dòng)，對(duì)精子產(chǎn)生機(jī)械壓逡逑力，破壞精子細(xì)胞膜和細(xì)胞器，使得細(xì)胞膜失去保護(hù)作用，破壞線粒體使精子失去運(yùn)動(dòng)逡逑能力。結(jié)晶越大對(duì)精子的危害越大。冰晶形成的過程主要是因?yàn)槔鋬鏊俾蔬^慢，冰晶主逡逑要在０？一６０°Ｃ形成，該溫度被稱為精子死亡溫度，在冷凍過程中應(yīng)迅速度過這一溫度逡逑區(qū)域，冷凍速率的快慢對(duì)冰晶的產(chǎn)生有著很大的影響［１９］（如圖１－２所示）②滲透壓理逡逑論：在冷凍過程中精子細(xì)胞膜外的水分首先結(jié)晶，致使精子細(xì)胞外液的滲透壓增大，使逡逑得局部滲透壓增高，精子內(nèi)部的水分會(huì)向外滲出造成精子脫水，細(xì)胞內(nèi)濃度增加酸堿失逡逑衡

取１１邋ｍＬＡ、Ｂ，Ａ１邋ｍＬＩＩ，照；Ｂ組精液１０邋ｍＬ裝于大ＥＰ管中，加入ｐＨ值為７．邋２的ＰＢＳ洗滌，緩慢混折均勻，逡逑４０００邋ｒｐｍ／ｍｉｎ離心３邋ｍｉｎ，棄上清液，重復(fù)洗漆３次。使用Ｔｒｉｓ—卵黃稀釋液１：４等溫逡逑稀釋，使用注射器輕輕吹打，使得精子均勻的分布在稀釋液中，分三批進(jìn)行精液冷凍，逡逑分別編號(hào)為Ｂｉ、Ｂ２、Ｂ３。逡逑２．２．３精液質(zhì)量檢測(cè)逡逑２．２．３．１精子活率檢測(cè)逡逑將染色液伊紅（５％）、苯胺黑（１％）按１邋：邋１混合，３７邋°Ｃ預(yù)熱。取少量稀釋后的精子與逡逑染色液迅速混合，制成抹片自然干燥，顯微鏡下觀察，死精子為紅色，活精子不著色或只逡逑在頭部的核環(huán)處呈淡紅色。隨機(jī)觀察２００個(gè)精子并計(jì)算出死活精子的比例［５５］。逡逑２．２．３．２質(zhì)膜完整性檢測(cè)逡逑取ｌｍＬ低滲液于ＥＰ管中，３７°Ｃ預(yù)熱３ｍｉｎ，取第一組精液Ｏ．ｌｍＬ加入預(yù)熱的低滲逡逑液中，３７°Ｃ水浴存放３０ｍｉｎ。在高倍鏡下計(jì)數(shù)２００個(gè)精子，計(jì)算出精子膨脹率。藍(lán)狐精逡逑子在低滲溶液中，尾部出現(xiàn)不同程度的膨脹、彎曲。尾部膜不完整精子不會(huì)膨脹。尾部逡逑膜較完整才會(huì)出現(xiàn)膨脹，其中尾部膜很完整會(huì)出現(xiàn)完全膨脹。（如圖２－１所示）逡逑

Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｄｅｔｅｃｔｏｒ邐Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｕｓｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｄｅｔｅｃｔｏｒ逡逑＿２＿７＿２人工授精逡逑將冷凍細(xì)管取出直接投入３７邋°Ｃ的溫水中并不斷晃動(dòng)細(xì)管，持續(xù)６０邋ｓ。取出細(xì)管用逡逑巾紙將細(xì)管表面的水擦干，剪開細(xì)管兩端倒入１．５邋ｍＬ無菌ＥＰ管中，３７邋°Ｃ水浴繼續(xù)逡逑蘇５邋ｍｉｎ，后進(jìn)行精子質(zhì)量檢測(cè)，精子活力達(dá)到０．３以上，采用子宮內(nèi)輸精（１次／ｄ逡逑３邋ｄ），輸精量１邋ｍＬ，有效精子數(shù)會(huì)２０Ｘ邋１０６以上。逡逑

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