發(fā)布時(shí)間：2020-07-07 17:13

【摘要】：煙草赤星病是由鏈格孢菌(Alternaria alternata)侵染引起的真菌病害,對(duì)煙草生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅,種植抗煙草赤星病品種是最經(jīng)濟(jì)有效的防治途徑。但是,煙草抗赤星病機(jī)理仍然不清楚,且煙草抗赤星病基因仍未實(shí)現(xiàn)精細(xì)定位,限制了優(yōu)異抗源的篩選、利用及抗性基因的挖掘。本研究利用抗病品種凈葉黃(JYH)、感病品種NC82及其F_(2:3)家系群體構(gòu)建了抗病親本池(JYH)、感病親本池(NC82)、抗病群體池(R-pool)、感病群體池(S-pool),采用iTRAQ技術(shù)開展了蛋白質(zhì)組差異分析,進(jìn)一步探究煙草抗赤星病機(jī)理,挖掘抗赤星病相關(guān)蛋白并進(jìn)行基因功能研究。1.利用iTRAQ技術(shù),從四組樣品中鑒定到可信蛋白3808個(gè)(FDR≤1%);篩選出差異表達(dá)蛋白605個(gè)(Foldchange為2倍),其中JYH vs NC82鑒定出差異蛋白355個(gè),R-pool vs S-pool鑒定出差異蛋白225個(gè)。JYH vs NC82和R-pool vs S-pool兩組樣品中有12個(gè)共同上調(diào)表達(dá)蛋白,11個(gè)共同下調(diào)表達(dá)蛋白。2.GO功能富集結(jié)果表明,差異蛋白主要參與光合作用、氧化還原、活性氧代謝等生物過程,定位在光合作用相關(guān)組件、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞組分上,具有氧化還原酶活性、氧化磷酸化、幾丁質(zhì)酶活性等分子功能;差異表達(dá)蛋白參與的KEGG代謝通路以與光合作用相關(guān)的物質(zhì)代謝為主,還包括磷酸戊糖、類黃酮生物合成、過氧化物酶體等代謝途徑。說明抗赤星病煙草品種(JYH)可能通過增強(qiáng)能量代謝、調(diào)控細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)以及提高應(yīng)激蛋白表達(dá)量提高自身的抗病性。3.在差異蛋白分析中,發(fā)現(xiàn)MLP423(Major latex-like protein 423)蛋白在抗病親本池和抗病群體池均顯著上調(diào)表達(dá)。本研究在普通煙草和本氏煙中克隆到MLP423編碼基因ORF序列NtMLP423和NbMLP423。生物信息學(xué)分析表明,NtMLP423和NbMLP423蛋白序列由152個(gè)氨基酸組成,具有Bet_v_1、“Gly-rich loop”結(jié)構(gòu)域,無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū),是典型的MLP蛋白家族成員。赤星病菌誘導(dǎo)下,NtMLP423和NbMLP423能夠快速響應(yīng)表達(dá),且NtMLP423在抗病品種JYH中的表達(dá)量顯著高于感病品種NC82。4.構(gòu)建了RFP-NbMLP423融合蛋白表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)NbMLP423主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。利用qRT-PCR分析NbMLP423在不同組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)NbMLP423在花、葉、莖、根中均有表達(dá),在葉中表達(dá)量最高。非生物脅迫處理后,NbMLP423在NaCl、4℃和干旱脅迫下表達(dá)量均顯著上調(diào),表明NbMLP423的表達(dá)受非生物脅迫的誘導(dǎo)。5.利用TRV載體成功構(gòu)建了NbMLP423 VIGS沉默系統(tǒng),與對(duì)照相比,NbMLP423瞬時(shí)沉默植株對(duì)煙草赤星病菌的抗性水平未發(fā)生顯著變化。構(gòu)建了NbMLP423過表達(dá)系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了NbMLP423在本氏煙中的高效率表達(dá),NbMLP423過表達(dá)植株和對(duì)照植株的病情指數(shù)分別為29.88和41.23,且病程相關(guān)蛋白基因NtPR10在過表達(dá)植株中的表達(dá)量顯著升高。表明NbMLP423過表達(dá)顯著增強(qiáng)了本氏煙對(duì)赤星病菌的抗病性。6.外源噴施SA、MeJA、ET等植物激素對(duì)NbMLP423具有顯著的誘導(dǎo)作用,且赤星病菌脅迫下,外源激素對(duì)NbMLP423的誘導(dǎo)效應(yīng)更加顯著。進(jìn)一步說明NbMLP423通過內(nèi)源激素信號(hào)途徑參與調(diào)控?zé)煵輰?duì)赤星病的抗性及其他生物過程。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.72
【圖文】：

赤星病菌誘導(dǎo)后不同時(shí)期 NtPR10 在感病品種和抗病品種中ression pattern of NtPR10 in different period after Alternaria a圖 1.2 煙草 PR10 蛋白抑制煙草赤星病菌活性分析

圖 1.2 煙草 PR10 蛋白抑制煙草赤星病菌活性分析Fig. 1.2 The antifungal activity of NtPR10 inhibiting Alternaria altemata菌生長(zhǎng)的抑制作用。1：dd H2O；2：20 μg/μL菌核凈。B：不同溶度煙草PR10蛋白溶1：1 μg/μL PR10蛋白；2：0.5 μg/μL PR10蛋白；3：0.25 μg/μL PR10蛋白；4：蛋白溶術(shù)及其應(yīng)用

士學(xué)位論文 第二章 煙草抗赤星病達(dá)蛋白篩選的條件下，去除反庫(kù)數(shù)據(jù)，共計(jì)得到可信蛋白 3808 個(gè)。按照hange 為 2 倍）的標(biāo)準(zhǔn)，直接采用兩比較組樣品不同重復(fù)的相差異表達(dá)蛋白 605 個(gè)。其中，R-pool vs S-pool 共鑒定出差異表達(dá) 個(gè)下調(diào)表達(dá)）；JYH vs NC82 共鑒定出差異表達(dá)蛋白 355 個(gè)（）（圖 2.1）。

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