發(fā)布時間：2020-07-07 05:03

【摘要】：煙粉虱Bemisia tabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)是半翅目粉虱科的一類重要的農業(yè)害蟲。近年來,Middle East-Asia Minor 1(MEAM1)、Mediterranean(MED)煙粉虱入侵危害,已對我國農業(yè)生產造成了嚴重影響。作為一種刺吸式口器植食性昆蟲,煙粉虱在取食寄主植物韌皮部汁液的同時分泌唾液幫助取食并調控植物的防御反應。截止到目前為止,只有少數(shù)刺吸式口器植食昆蟲的唾液蛋白被鑒定,更為重要的是,這些蛋白的功能及調控植物防御反應的作用與機理仍不清楚。因此,本文探究了煙粉虱唾液蛋白Bt56在煙粉虱-植物互作中的作用及其調控植物水楊酸信號途徑的部分機制。實驗室前人研究表明,煙粉虱的唾液蛋白Bt56是一個含有信號肽的小分子蛋白,在煙粉虱唾液腺主腺中特異性表達,能夠通過誘導植物水楊酸(salicylic acid)信號途徑促進煙粉虱在煙草上的存活。本研究通過酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)MED,MEAM1,Asia Ⅱ 1,Asia 113和China2等多個隱存種的煙粉虱唾液蛋白Bt56均能夠與煙草NTH202互作,并進一步對MED煙粉虱中的Bt56通過GST Pull-down和雙分子熒光互補(BiFC)的手段進一步進行了驗證。煙粉虱取食和過表達Bt56均顯著降低煙草中NTH202基因的表達水平。通過VIGS(virus induced gene silencing)的方法沉默煙草中NTH202基因對煙草的表型沒有明顯影響,但顯著提升煙粉虱在煙草上的存活率和產卵量。未被煙粉虱取食時,沉默NTH202基因的煙草中水楊酸含量與對照煙草相比沒有顯著差異;煙粉虱取食后,沉默NTH202基因的煙草和對照煙草中的水楊酸含量均顯著上調,但沉默NTH202基因的煙草中的水楊酸含量顯著高于對照煙草中的水楊酸含量。因此,我們推測NTH202除了在煙草中發(fā)揮其作為轉錄因子調控植物基因表達的作用外,可能在煙草中還有其他未知的功能,煙粉虱在長期的進化中獲得了保守地調節(jié)該蛋白的功能的能力,即分泌Bt56調節(jié)NTH202功能,從而幫助煙粉虱更好的取食。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了一個能與煙粉虱唾液蛋白Bt56互作的煙草NTH202蛋白,初步解析了其在煙粉虱-植物互作中的作用。本研究初步揭示了煙粉虱唾液效應因子Bt56調節(jié)寄主植物水楊酸信號途徑的機制,這對我們了解煙粉虱的入侵機制、選育抗蟲作物品種、發(fā)展新型煙粉虱的防控策略具有重要的指導意義。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S433.3
【圖文】：

學位論文邐煙草內與煙粉虱Ｂｔ５６蛋白互作蛋白的篩選與８０），邋ＭｔＫＮ０Ｘ４邋（ＡＢ０３３４８１），邋ＭｔＫＮＯＸ５邋（ＡＢ０３３４８２），邋ＭｄＫＮＡＰ３邋（Ｚ７１９８０），逡逑Ｂ０２５７１４），邋ＮＴＨ２２邋（ＡＢ０２５７１５），邋ＮｔＨ２３邋（ＢＡＡ２５９２１），邋ＮｔＨ２０１邋（ＢＡＦ９５７７６），邋Ｏｓｈ４５２），邋ＬｅＴ１２邋（ＡＡＣ４９９１８）．逡逑驗證結果顯示共轉ｐＧＢＫＴ７－Ｂｔ５６與ｐＧＡＤＴ７－ＮＴＨ２０２酵母菌株能夠在四缺ｄｅ／－Ｈｉｓ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ，補充有邋Ｘ－ａ－Ｇａｌ邋和邋ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ）上存活并變藍，相反５６和ＡＤ的酵母菌株和共轉ＢＤ和ＡＤ－ＮＴＨ２０２的酵母菌株均不能在四缺培圖３．２），說明Ｂｔ５６和ＮＴＨ２０２在酵母中是特異性互作的。逡逑ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２邋ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ邋ＢＤ＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２逡逑

基（ＳＤ／－Ａｄｅ／－Ｈｉｓ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ，補充有邋Ｘ－ａ－Ｇａｌ邋和邋ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ）上存活并變藍，相反的共逡逑轉ＢＤ－Ｂｔ５６和ＡＤ的酵母菌株和共轉ＢＤ和ＡＤ－ＮＴＨ２０２的酵母菌株均不能在四缺培養(yǎng)基逡逑上生長（圖３．２），說明Ｂｔ５６和ＮＴＨ２０２在酵母中是特異性互作的。逡逑ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２邋ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ邋ＢＤ＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２逡逑ＢｋＡＪ邋ＢＭＷ逡逑圖３．２酵母雙雜交驗證Ｂｔ５６與ＮＴＨ２０２間蛋白互作逡逑Ｆｉｇ．邋３．２邋ＮＴＨ２０２邋ｃｏｕｌｄ邋ｉｎｔｅｒａｃｔ邋ｗｉｔｈ邋Ｂｔ５６邋ｉｎ邋ｙｅａｓｔ邋ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ邋ｓｙｓｔｅｍｓ逡逑煙粉虱是一個具有超過３０個隱種復合體的物種（ＤｅＢａｒｒｏｅ／ａ／．邋２０１１；邋Ｄｉｎｓｄａｌｅｄａ／．逡逑２０１０；邋Ｌｉｕｅ／ａ／．邋２０１２；邋Ｆｉｒｄａｕｓ邋扣ａ／．邋２０１３；邋ＨｕｅＭ／．邋２０１４）。徐紅星（２０１５）從邋ＭＥＡＭ１，逡逑Ａｓｉａ邋ＩＩ邋３，Ａｓｉａｌｌ邋１邋和邋Ｃｈｉｎａ邋２邋四種粉虱中克隆了仇５６邋基因（ＧｅｎＢａｎｋ：邋ＫＹ９８６８７０，逡逑ＫＹ９８６８７１，邋ＫＹ９８６８７２，邋ＫＹ９８６８７３），通過分析表明以上４個隱種的Ｂｔ５６蛋白質序列都逡逑具有預測的信號肽，并且序列比對顯示出高度相似性。于是我們分別構建了對應的誘餌載逡逑體

ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ實驗使用２肫ＧＳＴ或ＧＳＴ－Ｂｔ５６融合蛋白來下拉２陴的ＭＢＰ或逡逑ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２融合蛋白。使用抗ＭＢＰ抗體進行蛋白質印跡以檢測相關蛋白質，用考馬斯逡逑藍染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝膠以監(jiān)測輸入蛋白量。如圖３．３所示，經(jīng)ｐｕｌｌｄｏｗｎ分析，ＮＴＨ２０２逡逑可與Ｂｔ５６在體外發(fā)生互作。逡逑ＧＳＴ邋ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ邐Ｉｎｐｕｔ逡逑ＧＳＴ邋＋邐＋邐－邐＋邐＋邐－邐－逡逑ＧＳＴ－Ｂｔ５６邐－邐－邐＋邐＋邐－邐－邐＋邐＋逡逑ＭＢＰ邐＋邐－邐＋邐－邐＋邐－邐＋邐－逡逑ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２邐－邐＋邐－邐＋邐－邐＋邐－邐＋逡逑ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２邐—邐—＊逡逑ＭＢＰ邐邐邋一逡逑ＧＳＴ－Ｂｔ５６邐４／０逡逑ＧＳＴ逡逑Ａｎｔｉ－ＭＢＰ邐Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ邋ｂｌｕｅ逡逑圖３．４邋ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ驗證Ｂｔ５６和ＮＴＨ２０２的體外互作。利用ＧＳＴ或ＧＳＴ－Ｂｔ５６融合蛋白逡逑對ＭＢＰ或ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２融合蛋白進行Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ分析。ＧＳＴ結合珠清洗后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ逡逑膠進行蛋白電泳，使用ＭＢＰ抗體進行蛋白質印跡以檢測相關蛋白質，用考馬斯藍染色逡逑ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝膠檢測各蛋白上樣量。逡逑Ｆｉｇ．３．４邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｉｎ邋ｔｏｂａｃｃｏ邋ｗｈｉｃｈ邋ｃｏｕｌｄ邋ｉｎｔｅｒａｃｔ邋ｗｉｔｈ邋Ｂｔ５６邋ｉｎ邋ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ邋ａｓｓａｙｓ．邋ＧＳＴ邋ｏｒ逡逑ＧＳＴ－Ｂｔ５６邋ｆｕｓｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｗｅｒｅ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｐｕｌｌ邋ｄｏｗｎ邋ＭＢＰ邋ｏｒ

【參考文獻】

相關期刊論文 前7條

1 秦麗;王佳;邴孝利;劉樹生;;利用mtCOIPCR-RFLP技術鑒定中國境內九個煙粉虱隱種[J];昆蟲學報;2013年02期

2 劉銀泉;劉樹生;;煙粉虱的分類地位及在中國的分布[J];生物安全學報;2012年04期

3 任順祥;邱寶利;戈峰;張友軍;杜予州;陳學新;郭建英;林克劍;彭正強;姚松林;胡雅輝;王聯(lián)德;張文慶;;粉虱類害蟲的監(jiān)測預警與可持續(xù)治理技術透視[J];應用昆蟲學報;2011年01期

4 嚴盈;劉萬學;萬方浩;;唾液成分在刺吸式昆蟲與植物關系中的作用[J];昆蟲學報;2008年05期

5 殷海娣;黃翠虹;薛X;王戎疆;閆鳳鳴;;昆蟲唾液成分在昆蟲與植物關系中的作用[J];昆蟲學報;2006年05期

6 褚棟,張友軍,叢斌,徐寶云,吳青君;云南Q型煙粉虱種群的鑒定[J];昆蟲知識;2005年01期

7 陳連根;煙粉虱在園林植物上為害及其形態(tài)變異[J];上海農學院學報;1997年03期

相關博士學位論文 前2條

1 潘李隆;中腸在煙粉虱傳播木爾坦棉花曲葉病毒中的作用及其機制[D];浙江大學;2017年

2 徐紅星;轉錄分析煙粉虱應對寄主轉換的分子機制及唾液效應因子BtQ56在其中的作用[D];浙江大學;2015年

相關碩士學位論文 前1條

1 邵若玄;MED煙粉虱唾液腺轉錄組分析與唾液蛋白的質譜鑒定[D];浙江大學;2017年

本文編號：2744687