【摘要】：煙粉虱Bemisia tabaci(Hemiptera:Aleyrodidae)是半翅目粉虱科的一類重要的農(nóng)業(yè)害蟲。近年來,Middle East-Asia Minor 1(MEAM1)、Mediterranean(MED)煙粉虱入侵危害,已對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響。作為一種刺吸式口器植食性昆蟲,煙粉虱在取食寄主植物韌皮部汁液的同時(shí)分泌唾液幫助取食并調(diào)控植物的防御反應(yīng)。截止到目前為止,只有少數(shù)刺吸式口器植食昆蟲的唾液蛋白被鑒定,更為重要的是,這些蛋白的功能及調(diào)控植物防御反應(yīng)的作用與機(jī)理仍不清楚。因此,本文探究了煙粉虱唾液蛋白Bt56在煙粉虱-植物互作中的作用及其調(diào)控植物水楊酸信號途徑的部分機(jī)制。實(shí)驗(yàn)室前人研究表明,煙粉虱的唾液蛋白Bt56是一個(gè)含有信號肽的小分子蛋白,在煙粉虱唾液腺主腺中特異性表達(dá),能夠通過誘導(dǎo)植物水楊酸(salicylic acid)信號途徑促進(jìn)煙粉虱在煙草上的存活。本研究通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MED,MEAM1,Asia Ⅱ 1,Asia 113和China2等多個(gè)隱存種的煙粉虱唾液蛋白Bt56均能夠與煙草NTH202互作,并進(jìn)一步對MED煙粉虱中的Bt56通過GST Pull-down和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)的手段進(jìn)一步進(jìn)行了驗(yàn)證。煙粉虱取食和過表達(dá)Bt56均顯著降低煙草中NTH202基因的表達(dá)水平。通過VIGS(virus induced gene silencing)的方法沉默煙草中NTH202基因?qū)煵莸谋硇蜎]有明顯影響,但顯著提升煙粉虱在煙草上的存活率和產(chǎn)卵量。未被煙粉虱取食時(shí),沉默NTH202基因的煙草中水楊酸含量與對照煙草相比沒有顯著差異;煙粉虱取食后,沉默NTH202基因的煙草和對照煙草中的水楊酸含量均顯著上調(diào),但沉默NTH202基因的煙草中的水楊酸含量顯著高于對照煙草中的水楊酸含量。因此,我們推測NTH202除了在煙草中發(fā)揮其作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物基因表達(dá)的作用外,可能在煙草中還有其他未知的功能,煙粉虱在長期的進(jìn)化中獲得了保守地調(diào)節(jié)該蛋白的功能的能力,即分泌Bt56調(diào)節(jié)NTH202功能,從而幫助煙粉虱更好的取食。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)能與煙粉虱唾液蛋白Bt56互作的煙草NTH202蛋白,初步解析了其在煙粉虱-植物互作中的作用。本研究初步揭示了煙粉虱唾液效應(yīng)因子Bt56調(diào)節(jié)寄主植物水楊酸信號途徑的機(jī)制,這對我們了解煙粉虱的入侵機(jī)制、選育抗蟲作物品種、發(fā)展新型煙粉虱的防控策略具有重要的指導(dǎo)意義。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S433.3
【圖文】：

學(xué)位論文邐煙草內(nèi)與煙粉虱Ｂｔ５６蛋白互作蛋白的篩選與８０），邋ＭｔＫＮ０Ｘ４邋（ＡＢ０３３４８１），邋ＭｔＫＮＯＸ５邋（ＡＢ０３３４８２），邋ＭｄＫＮＡＰ３邋（Ｚ７１９８０），逡逑Ｂ０２５７１４），邋ＮＴＨ２２邋（ＡＢ０２５７１５），邋ＮｔＨ２３邋（ＢＡＡ２５９２１），邋ＮｔＨ２０１邋（ＢＡＦ９５７７６），邋Ｏｓｈ４５２），邋ＬｅＴ１２邋（ＡＡＣ４９９１８）．逡逑驗(yàn)證結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)ｐＧＢＫＴ７－Ｂｔ５６與ｐＧＡＤＴ７－ＮＴＨ２０２酵母菌株能夠在四缺ｄｅ／－Ｈｉｓ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ，補(bǔ)充有邋Ｘ－ａ－Ｇａｌ邋和邋ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ）上存活并變藍(lán)，相反５６和ＡＤ的酵母菌株和共轉(zhuǎn)ＢＤ和ＡＤ－ＮＴＨ２０２的酵母菌株均不能在四缺培圖３．２），說明Ｂｔ５６和ＮＴＨ２０２在酵母中是特異性互作的。逡逑ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２邋ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ邋ＢＤ＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２逡逑

基（ＳＤ／－Ａｄｅ／－Ｈｉｓ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ，補(bǔ)充有邋Ｘ－ａ－Ｇａｌ邋和邋ＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ）上存活并變藍(lán)，相反的共逡逑轉(zhuǎn)ＢＤ－Ｂｔ５６和ＡＤ的酵母菌株和共轉(zhuǎn)ＢＤ和ＡＤ－ＮＴＨ２０２的酵母菌株均不能在四缺培養(yǎng)基逡逑上生長（圖３．２），說明Ｂｔ５６和ＮＴＨ２０２在酵母中是特異性互作的。逡逑ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２邋ＢＤ－Ｂｔ５６＋ＡＤ邋ＢＤ＋ＡＤ－ＮＴＨ２０２逡逑ＢｋＡＪ邋ＢＭＷ逡逑圖３．２酵母雙雜交驗(yàn)證Ｂｔ５６與ＮＴＨ２０２間蛋白互作逡逑Ｆｉｇ．邋３．２邋ＮＴＨ２０２邋ｃｏｕｌｄ邋ｉｎｔｅｒａｃｔ邋ｗｉｔｈ邋Ｂｔ５６邋ｉｎ邋ｙｅａｓｔ邋ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ邋ｓｙｓｔｅｍｓ逡逑煙粉虱是一個(gè)具有超過３０個(gè)隱種復(fù)合體的物種（ＤｅＢａｒｒｏｅ／ａ／．邋２０１１；邋Ｄｉｎｓｄａｌｅｄａ／．逡逑２０１０；邋Ｌｉｕｅ／ａ／．邋２０１２；邋Ｆｉｒｄａｕｓ邋扣ａ／．邋２０１３；邋ＨｕｅＭ／．邋２０１４）。徐紅星（２０１５）從邋ＭＥＡＭ１，逡逑Ａｓｉａ邋ＩＩ邋３，Ａｓｉａｌｌ邋１邋和邋Ｃｈｉｎａ邋２邋四種粉虱中克隆了仇５６邋基因（ＧｅｎＢａｎｋ：邋ＫＹ９８６８７０，逡逑ＫＹ９８６８７１，邋ＫＹ９８６８７２，邋ＫＹ９８６８７３），通過分析表明以上４個(gè)隱種的Ｂｔ５６蛋白質(zhì)序列都逡逑具有預(yù)測的信號肽，并且序列比對顯示出高度相似性。于是我們分別構(gòu)建了對應(yīng)的誘餌載逡逑體

ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ實(shí)驗(yàn)使用２肫ＧＳＴ或ＧＳＴ－Ｂｔ５６融合蛋白來下拉２陴的ＭＢＰ或逡逑ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２融合蛋白。使用抗ＭＢＰ抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡以檢測相關(guān)蛋白質(zhì)，用考馬斯逡逑藍(lán)染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝膠以監(jiān)測輸入蛋白量。如圖３．３所示，經(jīng)ｐｕｌｌｄｏｗｎ分析，ＮＴＨ２０２逡逑可與Ｂｔ５６在體外發(fā)生互作。逡逑ＧＳＴ邋ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ邐Ｉｎｐｕｔ逡逑ＧＳＴ邋＋邐＋邐－邐＋邐＋邐－邐－逡逑ＧＳＴ－Ｂｔ５６邐－邐－邐＋邐＋邐－邐－邐＋邐＋逡逑ＭＢＰ邐＋邐－邐＋邐－邐＋邐－邐＋邐－逡逑ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２邐－邐＋邐－邐＋邐－邐＋邐－邐＋逡逑ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２邐—邐—＊逡逑ＭＢＰ邐邐邋一逡逑ＧＳＴ－Ｂｔ５６邐４／０逡逑ＧＳＴ逡逑Ａｎｔｉ－ＭＢＰ邐Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ邋ｂｌｕｅ逡逑圖３．４邋ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ驗(yàn)證Ｂｔ５６和ＮＴＨ２０２的體外互作。利用ＧＳＴ或ＧＳＴ－Ｂｔ５６融合蛋白逡逑對ＭＢＰ或ＭＢＰ－ＮＴＨ２０２融合蛋白進(jìn)行Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ分析。ＧＳＴ結(jié)合珠清洗后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ逡逑膠進(jìn)行蛋白電泳，使用ＭＢＰ抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡以檢測相關(guān)蛋白質(zhì)，用考馬斯藍(lán)染色逡逑ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝膠檢測各蛋白上樣量。逡逑Ｆｉｇ．３．４邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｉｎ邋ｔｏｂａｃｃｏ邋ｗｈｉｃｈ邋ｃｏｕｌｄ邋ｉｎｔｅｒａｃｔ邋ｗｉｔｈ邋Ｂｔ５６邋ｉｎ邋ＧＳＴ邋Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ邋ａｓｓａｙｓ．邋ＧＳＴ邋ｏｒ逡逑ＧＳＴ－Ｂｔ５６邋ｆｕｓｉｏｎ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｗｅｒｅ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｐｕｌｌ邋ｄｏｗｎ邋ＭＢＰ邋ｏｒ

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2744687