【摘要】：熱激蛋白(heat shock proteins,Hsp)是一類受脅迫而誘導(dǎo)大量表達(dá)的蛋白質(zhì),普遍存在于植物和動(dòng)物細(xì)胞中。作為分子伴侶的核心成分,Hsp在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解,在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。近年來(lái),Hsp70被發(fā)現(xiàn)廣泛參與到病毒的侵入、解聚、復(fù)制、運(yùn)動(dòng)、基因表達(dá)和病毒粒子形成等過(guò)程中,但Hsp70與病毒不同組分的互作如何協(xié)同調(diào)控病毒的復(fù)制循環(huán)仍有待深入研究。小熱激蛋白(sHsp)參與病毒侵染的報(bào)道較少,多見(jiàn)于動(dòng)物病毒的研究,sHsp如何調(diào)控植物病毒侵染及其分子機(jī)制仍不清楚�；诖�,本研究以甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus,BBSV)為材料,對(duì)CP、p23和Hsc70-2三者的互作關(guān)系及其如何調(diào)控病毒侵染進(jìn)行了較深入地探索,并對(duì)Hsp17.6在BBSV侵染中的功能進(jìn)行了初步分析。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn),Hsc70-2存在于BBSV外殼蛋白(coat protein,CP)和復(fù)制輔助蛋白p23的免疫共沉淀復(fù)合物中,在此基礎(chǔ)上,本研究首先克隆了本生煙(Nicotiana benthamiana)Hsc70-2基因,利用pull-down、雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)、免疫共沉淀(Co-IP)和螢火蟲(chóng)熒光素酶互補(bǔ)成像(LCI)等實(shí)驗(yàn)技術(shù),證明Hsc70-2分別與CP和p23直接互作,而CP和p23之間不存在相互作用,且三者不能通過(guò)Hsc70-2形成復(fù)合體。Hsc70-2與CP互作發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中且形成較大的聚集體,Hsc70-2與p23互作發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的聚集體中。Pull-down和BiFC結(jié)果表明,CP和p23都結(jié)合Hsc70-2的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding domain,NBD)。BBSV侵染溫和地誘導(dǎo)Hsc70-2表達(dá)上調(diào),超表達(dá)Hsc70-2促進(jìn)BBSV在本生煙中的侵染;相反,下調(diào)Hsc70-2的表達(dá)則嚴(yán)重影響B(tài)BSV的復(fù)制水平,說(shuō)明Hsc70-2是BBSV復(fù)制所必需的宿主因子。侵染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CP負(fù)調(diào)控病毒的復(fù)制,破壞CP的RNA結(jié)合活性,病毒(BBSVmMP/CP△N21)的復(fù)制水平仍顯著低于CP缺失突變體(BBSVmMP/mCP)的復(fù)制水平,說(shuō)明CP負(fù)調(diào)控BBSV的復(fù)制還可能存在其他機(jī)制。超表達(dá)Hsc70-2能降低CP對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用,競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明CP干擾Hsc70-2與p23間的相互作用,暗示CP的表達(dá)會(huì)影響病毒復(fù)制復(fù)合體的形成。這些研究結(jié)果表明,BBSV可通過(guò)不同組分劫持Hsc70-2這一寄主因子,進(jìn)而調(diào)控病毒的復(fù)制和侵染,這為深入理解Hsp70家族蛋白在病毒侵染中的不同作用提供了新的視角。本實(shí)驗(yàn)室前期還發(fā)現(xiàn)BBSV侵染誘導(dǎo)Hsp17.6上調(diào),沉默Hsp17.6則會(huì)降低病毒在本生煙中的侵染。在此基礎(chǔ)上,本研究通過(guò)熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)證明HsP17.6確實(shí)具有分子伴侶活性,組織特異性表達(dá)分析顯示Hsp17.6主要在植物的種子中表達(dá),其次是植物的根和葉。亞細(xì)胞定位分析表明Hsp17.6定位于細(xì)胞質(zhì),形成大小不一的聚集體且部分聚集體在細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生移動(dòng),有意思的是,BBSV侵染使得Hsp17.6的定位由聚集體形式變?yōu)榫鶆蚍植?結(jié)合BBSV侵染誘導(dǎo)Hsp90上調(diào)表達(dá)、共表達(dá)Hsp90引起Hsp17.6發(fā)生類似的定位改變等實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們認(rèn)為Hsp17.6定位的變化可能是由于BBSV侵染誘導(dǎo)Hsp90上調(diào)表達(dá)而間接引起的。超表達(dá)Hsp17.6蛋白并不能促進(jìn)BBSV的侵染,沉默Hsp17.6減弱BBSV的侵染但不影響病毒的復(fù)制,暗示Hsp17.6可能在病毒的運(yùn)動(dòng)中起作用。BiFC和pull-down實(shí)驗(yàn)表明,Hsp17.6與BBSV的運(yùn)動(dòng)蛋白p7a存在相互作用;BiFC和Co-IP實(shí)驗(yàn)也證明,Hsp17.6與Actin互作,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明Hsp17.6可能在介導(dǎo)BBSV運(yùn)動(dòng)復(fù)合體沿著Actin的運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S432.41
【圖文】：

Ｈｓｐ｜：Ｐｉ邋卜－逡逑Ｉ、人逡逑Ｈ0ｐｔ逡逑Ｈｓｐ９０逡逑圖１－１邋Ｈｓｐ７０的分子伴侶功能循環(huán)模型（Ｍａｙｅｒ，２００５）逡逑當(dāng)Ｈｓｐ７０結(jié)合ＡＴＰ時(shí)，其對(duì)底物的親和力較低，有利于折疊至天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)的釋放并快速加載變性的蛋白質(zhì)，逡逑輔助分子伴侶ＪＤＰ促進(jìn)Ｈｓｐ７０水解ＡＴＰ引起Ｈｓｐ７０構(gòu)象發(fā)生改變，此時(shí)Ｈｓｐ７０緊密地結(jié)合底物并進(jìn)行蛋白質(zhì)的逡逑折疊。在核苷酸交換因子的作用下，Ｈｓｐ７０上ＡＤＰ－ＡＴＰ快速交換，同時(shí)使Ｈｓｐ７０回到最初的構(gòu)象，釋放折疊好的逡逑蛋白質(zhì)并開(kāi)始新的伴侶功能循環(huán)。在輔助分子伴侶Ｈｏｐ的幫肋下，Ｈｓｐ７０可與Ｈｓｐ９０協(xié)同作用促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的逡逑重新折疊。藍(lán)色圖形表示Ｈｓｐ７０，黃色線條表示底物蛋白。逡逑許多病毒侵染能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞大量表達(dá)Ｈｓｐ７０邋（Ｃｈｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００８ｂ；邋Ｎａｇｙ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１１；邋Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ逡逑ｅｔａｌ．，２００９；Ｙａｏｅｔａｌ．，２０１７），表明Ｈｓｐ７０在病毒侵染中發(fā)揮重要作用。Ａｐａｒｉｃｉｏ等人提出誘導(dǎo)表達(dá)逡逑Ｈｓｐ７０可能與病毒ＲＮＡ的復(fù)制不是直接相關(guān)的

Ｈｓｃ７０，缺失ＳＧＴＡ增強(qiáng)ＳＶ４０與Ｈｓｃ７０的親和力，但這不利于ＳＶ４０有效地釋放到細(xì)胞質(zhì)中。超逡逑表達(dá)ＳＧＴＡ促進(jìn)Ｈｓｃ７０對(duì)底物的結(jié)合從高親和的ＡＤＰ－Ｈｓｃ７０態(tài)向低親和的ＡＴＰ－Ｈｓｃ７０態(tài)的轉(zhuǎn)變，逡逑這不利于病毒粒子結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ｈｓｃ７０，因此也不利于ＳＶ４０高效地釋放到細(xì)胞質(zhì)中（圖１－２）。逡逑ＳＧＴＡ如何適時(shí)地促進(jìn)與減弱Ｈｓｃ７０與病毒粒子的親和力尚不清楚。此外，Ｈｓｐｌ０５、Ｈｓｃ７０和Ｊ蛋逡逑白協(xié)同作用組成解聚機(jī)器（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ邋ｍａｃｈｉｎｅｒｙ），負(fù)責(zé)清理細(xì)胞內(nèi)聚集的蛋白質(zhì)，這種解聚逡逑機(jī)器可能被ＳＶ４０劫持以促進(jìn)其進(jìn)入宿主細(xì)胞（Ｒａｖｉｎｄｒａｎｅｔａｌ．，２０１５）。目前尚沒(méi)有Ｈｓｐ７０家族蛋逡逑白調(diào)控植物病毒侵入細(xì)胞的報(bào)道。逡逑１．１．１．２Ｈｓｐ７０調(diào)控病毒的解聚、組裝與釋放逡逑Ｈｓｐ７０在動(dòng)物病毒的解聚、組裝和釋放等過(guò)程中都起重要的作用。在多瘤病毒感染３邋ｈ時(shí)，逡逑Ｈｓｐ７０就能與病毒粒子ＶＰ１結(jié)合，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中，Ｈｓｐ７０以水解ＡＴＰ提供的能量有效地促進(jìn)逡逑多瘤和乳頭瘤病毒樣顆粒和病毒粒子解聚（Ｃｈｒｏｍｙ邋ｅｔａｌ．，２００６）。Ｉｖａｎｏｖｉｃ等人利用網(wǎng)織紅細(xì)胞裂逡逑解物重現(xiàn)完整的５分子的釋放。在這個(gè)系統(tǒng)中，用Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０抗體封閉Ｈｓｃ７０／Ｈｓｐ７０減少了邋５逡逑的釋放

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