【摘要】：煙草曲莖病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)的單組分病毒,經(jīng)煙粉虱(Bemisia tabaci)傳播,在番茄和煙草上可引起嚴重的曲葉病,造成嚴重經(jīng)濟損失。vsiRNAs(virus-derived small interfering RNAs)介導(dǎo)的RNA沉默主要靶向病毒自身基因組和寄主的mRNA對其進行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。本試驗以本氏煙(Nicotiana benthamiana)為試驗材料,研究TbCSV及其伴隨衛(wèi)星(Tobacco curly shootβsatellite,TbCSB)病害復(fù)合體來源的vsiRNAs在病毒侵染過程中的作用,試驗結(jié)果將有助于解析TbCSV/TbCSB誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生典型癥狀的作用機制。為驗證TbCSV/TbCSB復(fù)合侵染本氏煙后是否產(chǎn)生vsiRNAs,本研究利用小RNA測序技術(shù)對TbCSV/TbCSB復(fù)合侵染后本氏煙、TbCSV單獨侵染后本氏煙進行小RNA測序分析,結(jié)果顯示,TbCSV/TbCSB處理組中共測得1165882條vsiRNAs,特異的有87315條;TbCSV處理組中共測得217272條vsiRNAs,特異的有32192條。在兩組處理中來源于TbCSV和TbCSB的vsiRNAs大小均主要為21 nt和22 nt,主要分布于TbCSV和TbCSB編碼蛋白的開放閱讀框(open reading frames,ORFs)內(nèi),且首位堿基主要為尿嘧啶(Uracil,U)。對vsiRNAs的產(chǎn)生熱點分析顯示,TbCSV/TbCSB復(fù)合侵染的TbCSV基因組上共有55個熱點,在TbCSB上共有17個熱點;TbCSV單獨侵染的TbCSV基因組上共有49個熱點。本試驗選取了55個reads數(shù)超過2000的來源于TbCSV/TbCSB復(fù)合侵染的TbCSV來源的vsiRNAs與各個基因mRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列進行比對,得到19個來源于TbCSV mRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的小RNA。進一步利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得14個vsiRNAs。為了驗證病毒產(chǎn)生的vsiRNAs是否在病毒侵染過程中起作用,我們將驗證得到的14個vsiRNAs分別構(gòu)建至甘藍曲葉病毒(Cabbage leaf curl virus,CaLCuV)表達載體(pCVA)中,經(jīng)農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)在本氏煙體內(nèi)表達,分析vsiRNAs表達后對本氏煙植株生長的影響。結(jié)果顯示,其中有3個vsiRNAs表達后造成本氏煙生長異常,分別命名為Y35A8、Y35A14、Y35A18。Y35A8表達后本氏煙葉片向下卷曲并有黃脈癥狀;Y35A14表達后本氏煙心葉嚴重向下卷曲且伴有黃脈癥狀,下部葉片也有輕微黃脈癥狀;Y35A18表達后本氏煙上整個頂部葉片卷曲并有黃脈癥狀。為進一步研究vsiRNA Y35A8、Y35A14、Y35A18表達后對病毒侵染的影響,分別在這3個小RNA表達15 d后接種TbCSV/TbCSB侵染性克隆,接種8 d和45 d后,觀察本氏煙的表型變化,并用qPCR方法分析病毒積累量。結(jié)果顯示,與未表達vsiRNA植株相比較,表達這3個vsiRNA的本氏煙上病毒癥狀更加嚴重,主要表現(xiàn)為嚴重的葉片卷曲以及莖稈扭曲;qPCR檢測病毒積累量,結(jié)果顯示,在表達Y35A8的本氏煙上,病毒積累量比對照組高而衛(wèi)星積累量比對照組低;在表達Y35A14的本氏煙上,病毒和衛(wèi)星的積累量均比對照組高;在表達Y35A18的本氏煙上,病毒積累量前期比對照組高而后期比對照組低,衛(wèi)星積累量前期比對照組高而后期與對照組基本一致。以上結(jié)果說明病毒來源的vsiRNAs在病毒侵染過程中對寄主和病毒都產(chǎn)生了影響。為了研究Y35A8、Y35A14、Y35A18是否靶向寄主mRNA從而行使功能,我們結(jié)合psRNATarget靶基因預(yù)測網(wǎng)站和RT-qPCR方法驗證到有4個靶基因符合小RNA負調(diào)控,表達下調(diào);分別命名為Y35A8-6、Y35A14-2、Y35A14-3、Y35A18-8。靶基因Y35A8-6 ID為Niben101Scf04410g04006.1,屬于蛋白酶抑制子家族基因;靶基因Y35A14-2 ID為Niben101Scf23557g00007.1,屬于亮氨酸重復(fù)序列類受體蛋白激酶基因家族基因;靶基因Y35A14-3 ID為Niben101Scf03194g01005.1,為跨膜轉(zhuǎn)運蛋白家族基因;靶基因Y35A18-8 ID為Niben101Scf03009g05001.1,為富亮氨酸重復(fù)序列家族基因。我們進一步利用煙草脆裂病毒(Tabacco rattle virus,TRV)介導(dǎo)這4條基因下調(diào)表達從而研究其對寄主和病毒的影響。結(jié)果顯示,分別將這4條基因沉默后的處理組植株的表型與對照組植株相比沒有差異;基因沉默10 d后繼續(xù)接種TbCSV/TbCSB第10 d,基因Y35A8-6、Y35A18-8處理組上病毒侵染會造成頂端葉片卷曲較對照嚴重,基因Y35A14-2、Y35A14-3處理組上與對照相比表型沒有差異;qPCR結(jié)果顯示,處理組中TbCSV和TbCSB的積累量均比對照要低。以上研究表明,TbCSV/TbCSB侵染本氏煙后產(chǎn)生vsiRNAs,且部分vsiRNAs會影響寄主的正常生長和協(xié)助病毒侵染并造成較嚴重癥狀,以及增強病毒在寄主中的積累量,表明其可能參與了病毒與寄主的互作過程。此外,qPCR分析得到的4條靶基因下調(diào)表達后導(dǎo)致病毒和衛(wèi)星的積累量降低,表明其對病毒的侵染和復(fù)制也造成了影響。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S435.72

【參考文獻】

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本文編號：2737407