【摘要】：大部分的黃單胞菌都屬于植物病原細(xì)菌,能侵染多種植物,造成植物發(fā)生葉枯、葉斑、潰瘍等癥狀。寄主植物包括了很多人類賴以生存的糧食、蔬菜和果木。本實(shí)驗(yàn)研究的水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)是水稻黃單胞菌的一個(gè)致病變種,該病菌菌體為短桿狀,極生單鞭毛,革蘭氏染色呈陰性,不形成芽孢,也不形成莢膜,菌體有粘性胞外多糖包圍。水稻白葉枯病菌由葉片的水孔、傷口侵入,沿著葉脈維管束會產(chǎn)生灰白色的病斑,每年造成水稻嚴(yán)重減產(chǎn),因此對水稻白葉枯病菌的研究是十分必要的。近年來,人們對水稻白葉枯病菌致病分子機(jī)理研究方面取得了一定進(jìn)展,但是在黃單胞菌對寄主的識別機(jī)制方面的研究并不是很多,而水稻白葉枯病菌中的甲基趨化性受體蛋白(methyl-accepting chemotaxis proteins,MCP)在它對寄主的識別與早期侵染定殖中起著重要的作用,值得進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)致力于初步明確趨化受體基因在水稻白葉枯病菌中的功能,找出水稻白葉枯病前期侵染水稻的關(guān)鍵基因,為進(jìn)一步研究趨化系統(tǒng)在水稻白葉枯病菌早期侵染及定殖中的作用奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)從水稻白葉枯病菌Xoo PXO99A全基因組水平出發(fā),通過生物信息學(xué)的方法確定了候選的10個(gè)mcp基因以及一個(gè)疑似基因,主要使用同源雙交換的方法對目標(biāo)基因和基因簇進(jìn)行突變,對mcp基因功能研究,得到如下結(jié)果:(1)全基因組搜尋mcp基因。MA結(jié)構(gòu)域是一個(gè)典型的MCP蛋白結(jié)構(gòu)域,因此本實(shí)驗(yàn)在全基因組的水平上掃描MA結(jié)構(gòu)域編碼區(qū),確認(rèn)了候選的10個(gè)mcp基因。它們分別是PXO_00036、PXO_00039、PXO_00041、PXO_00043、PXO_00045、、PXO_00046、PXO_00047、、PXO_00054、PXO_06142和PXO_04751。GenBanK數(shù)據(jù)中原注釋為mcp基因的PXO_00916,其編碼產(chǎn)物沒有MA結(jié)構(gòu)域,確認(rèn)不屬于mep基因。(2)完成構(gòu)建mcp基因突變體和MCPfree菌株。設(shè)計(jì)各個(gè)基因號對應(yīng)的引物,構(gòu)建中間體質(zhì)粒,通過三親本接合或者電轉(zhuǎn)化的方式把質(zhì)粒導(dǎo)入到水稻白葉枯病菌野生型菌株P(guān)X099A中,采用同源雙交換的突變手段,之后通過抗性篩選及PCR驗(yàn)證最終獲得了水稻白葉枯病菌全部mcp基因的缺失突變體以及一個(gè)缺失了所有mcp基因的MCPfree菌株。之后利用分子克隆手段將mcp基因與質(zhì)粒pXUK連接構(gòu)建互補(bǔ)載體,并得到的相應(yīng)的反式功能互補(bǔ)菌株。之后進(jìn)一步逐個(gè)將互補(bǔ)載體互補(bǔ)到MCP free菌株中,觀察該菌的表型及致病力變化,驗(yàn)證了mc 基因PXO_06142在水稻白葉枯病侵染過程中起著關(guān)鍵的作用。(3)對所有的突變體進(jìn)行了基本表型的檢測。實(shí)驗(yàn)表明:在所有的突變體中,基因號為PXO-0_041、PXO_00045的突變體游動(dòng)性輕微下降,基因號為PXO_6142的缺失突變體和MCP free菌株游動(dòng)性顯著下降。基因號為PXO_4751、PXO_06142的缺失突變體和和MCP free菌株涌動(dòng)性顯著降低。PXO_04751缺失突變體抗?jié)B透壓能力減弱。(4)對所有的突變體進(jìn)行了致病力的檢測。發(fā)現(xiàn)在剪葉接種的情況下,各個(gè)突變體與野生型相比,致病力并沒有表現(xiàn)出明顯的差異。為了更加準(zhǔn)確地檢測各個(gè)突變體以及MCP free菌株致病力的變化,因此本實(shí)驗(yàn)采用非創(chuàng)傷型噴霧接種方法來檢測各個(gè)突變體以及MCP free菌株致病力的變化。實(shí)驗(yàn)表明,在噴霧接種實(shí)驗(yàn)中,PXO_06142的缺失突變體和和MCPfree菌株的致病力較野生型顯著降低。而將基因PXO_06142回補(bǔ)至MCP free菌株中,致病力能夠補(bǔ)回。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建單個(gè)基因缺失突變體后,發(fā)現(xiàn)基因PXO_06142對侵染水稻起著重要的作用,因此進(jìn)一步構(gòu)建了一個(gè)MCP free菌株并將各個(gè)基因逐一回補(bǔ)到MCP free中,然后逐個(gè)檢測表型和致病力,進(jìn)一步驗(yàn)證了基因PXO_06142的關(guān)鍵作用。得到以下結(jié)論:水稻白葉枯病病菌的mcp基因在該病菌的前期定殖與侵染中起著重要的作用,而在所有的mcp基因中,基因PXO_06142對表型和致病力有著顯著影響,扮演著重要的角色。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S435.111.47
【圖文】：

圖１－１邋ＭＣＰ的結(jié)構(gòu)與分類［１７］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＭＣＰ逡逑

內(nèi)外引物進(jìn)行候選菌株的ＰＣＲ檢驗(yàn)。如果外引擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為目的基因左右臂之逡逑和，用內(nèi)引驗(yàn)證無法擴(kuò)增出條帶，則可以說明相應(yīng)的突變體己經(jīng)構(gòu)建成功。以／？�；义弦�?yàn)槔�，該基因的缺失突變體的驗(yàn)證如圖３－６所示：逡逑４５逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 于慧敏;馬玉超;;工業(yè)微生物代謝途徑調(diào)控的基因敲除策略[J];生物工程學(xué)報(bào);2010年09期

2 梁景平;菌毛的類型及其作用機(jī)制[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;1998年01期

3 郭亞輝;黃單胞菌屬的分類研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)雜志;1997年04期

本文編號：2730569