【摘要】：玉米大斑病(Exserohilum turcicum)是一種主要的世界性病害,嚴(yán)重爆發(fā)地區(qū)的感病品種減產(chǎn)可達(dá)50%左右,種植抗病品種是防治大斑病最經(jīng)濟(jì)、有效的措施。為培育抗病新品種,篩選鑒定抗病相關(guān)基因已成為有效防控玉米大斑病的重要研究任務(wù)。所以從基因水平上揭示玉米在大斑病菌侵染過(guò)程中可能參與抗病反應(yīng)的相關(guān)基因并對(duì)抗病相關(guān)基因進(jìn)行克隆與功能分析,可為抗病分子育種提供科學(xué)依據(jù)及優(yōu)良的抗病基因資源。楊樹(shù)灰斑病(Phyllosticta populea Sacc)是楊樹(shù)主要病害之一,發(fā)生面積大且危害嚴(yán)重,目前已成為楊樹(shù)人工林急待解決的問(wèn)題。種植抗病品種是防治楊樹(shù)灰斑病的最安全、有效的措施,但因抗病種質(zhì)資源匾乏,極大地阻礙了楊樹(shù)抗病品種的選育。楊樹(shù)作為轉(zhuǎn)基因的木本模式植物,采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源抗病基因轉(zhuǎn)入其基因組中是防治楊樹(shù)灰斑病行之有效的方法。病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein,PRP)是植物在病原物入侵等逆境脅迫過(guò)程中誘導(dǎo)表達(dá)的一類(lèi)蛋白質(zhì),其功能大多與植物抗病反應(yīng)密切相關(guān)。隨著對(duì)其生化性質(zhì)、作用機(jī)理、表達(dá)調(diào)控的深入研究,用病程相關(guān)蛋白基因轉(zhuǎn)化植株日益成為植物防御病害的有效途徑。本研究以抗病玉米自交系C103HtN為植物材料,采用RNA-seq測(cè)序技術(shù),構(gòu)建玉米響應(yīng)大斑病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,篩選抗病相關(guān)基因;并對(duì)差異表達(dá)病程相關(guān)蛋白ZmPR-1和ZmPR-4基因進(jìn)行克隆與功能分析,明確它們?cè)诳褂衩状蟀卟�、楊�?shù)灰斑病反應(yīng)中的作用,探索病程相關(guān)蛋白ZmPR-1、ZmPR-4基因的功能特性。這將進(jìn)一步豐富病程相關(guān)蛋白與植物抗病關(guān)系的研究,同時(shí)也為利用植物基因工程防治植物病害的新途徑提供理論依據(jù)及優(yōu)良的抗病基因資源。研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了 9個(gè)大斑病菌誘導(dǎo)下玉米轉(zhuǎn)錄組文庫(kù),共獲得差異表達(dá)基因5903個(gè),其中有3195個(gè)基因上調(diào)表達(dá),2708個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。差異表達(dá)基因GO和KEGG功能顯著性富集分析結(jié)果顯示:與玉米抗逆響應(yīng)關(guān)系密切的主要有乙烯代謝途徑(ethylene metabolic process)GO:0009692、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性/茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)通路(induced systemic resistance/jasmonic acid mediated signaling pathway)G0:0009864、水楊酸介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑(salicylic acid mediated signaling pathway)G0:0009863、MAPK 信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)ko04010、植物-病原體相互作用(Plant-pathogen interaction)ko04626等。并對(duì)植物與病原相互作用的基因、植物抗逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、植物激素相關(guān)基因和植物抗氧相關(guān)基因四類(lèi)差異表達(dá)基因進(jìn)行了表達(dá)模式分析。由此可見(jiàn),大斑病菌誘發(fā)了玉米多種抗病信號(hào)通路及信號(hào)傳導(dǎo)途徑,暗示玉米響應(yīng)大斑病菌侵染的分子機(jī)制受到多基因網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的調(diào)控。隨機(jī)選擇8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果證明Illumina RNA-Seq測(cè)序結(jié)果是可靠的。(2)通過(guò)基因差異表達(dá)分析,從中篩選了一個(gè)PR-1基因進(jìn)行克隆及功能分析。ZmPR-1基因cDNA全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框?yàn)?04bp,編碼167氨基酸,ZmPR-1蛋白具有PR-1基因家族完整的SCP超家族保守結(jié)構(gòu)域,同多種植物的PR1蛋白同源性極高。干旱、鹽、大斑病菌及其代謝物均可顯著誘導(dǎo)該基因表達(dá)。構(gòu)建植物表達(dá)載體,對(duì)其進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化,獲得14株陽(yáng)性株系。陽(yáng)性株系抗病性測(cè)定結(jié)果顯示:ZmPR-1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中過(guò)量表達(dá)可提高其對(duì)玉米大斑病菌的抗性�？剐灾晗禑煵萑~片防御酶活性的測(cè)定結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因煙草在玉米大斑病菌脅迫下其超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性均顯著提高。初步明確ZmPR-1基因具有抗玉米大斑病菌的功能。(3)通過(guò)基因差異表達(dá)分析,從中篩選了一個(gè)PR-4基因進(jìn)行克隆及功能分析。ZmPR-4基因cDNA全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框?yàn)?92bp,編碼163氨基酸,并在23和24個(gè)氨基酸之間有一個(gè)明顯的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。干旱、鹽、大斑病菌及其代謝物均可顯著誘導(dǎo)該基因表達(dá)。構(gòu)建植物表達(dá)載體,對(duì)其進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化,獲得7株陽(yáng)性株系。陽(yáng)性株系抗病性測(cè)定結(jié)果顯示:玉米ZmPR-4基因在轉(zhuǎn)基因煙草中過(guò)量表達(dá)可提高其對(duì)玉米大斑病菌的抗性�？剐灾晗禑煵萑~片防御酶活性的測(cè)定結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因煙草在玉米大斑病菌脅迫下其SOD、POD和CAT活性均顯著提高。初步明確ZmPR-4基因具有玉米抗大斑病菌的功能。(4)ZmPR1和ZwPR4基因在煙草中過(guò)量表達(dá)均提高了轉(zhuǎn)基因株系對(duì)楊樹(shù)灰斑病菌(P.populea Sacc)的抗病性。對(duì)抗性株系煙草葉片防御酶活性、總酚含量和丙二醛(MDA)含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草Nu-ZmPR-1、Nu-ZmPR-4在楊樹(shù)灰斑病菌脅迫下顯著提高了苯丙氨酸解氨酶(PAL)、POD、SOD和CAT活性,提高了總酚含量,而降低了 MDA含量。初步明確ZwPR-1、ZmPR-4基因?qū)顦?shù)灰斑病菌具有一定的抗性。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S435.131;S763.7
【圖文】：

２．２．３大斑病菌誘導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序逡逑９個(gè)樣本的ｃＤＮＡ文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序均由上海生工生物工程股份有限公司完成，具體逡逑構(gòu)建及測(cè)序流程如圖２－１所示。采用Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋ＨｉＳｅｑ？邋２５００測(cè)序平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的玉米轉(zhuǎn)錄逡逑組文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，鑒于數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率對(duì)結(jié)果的影響，采用軟件ｃｕｔａｄａｐｔ對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)逡逑行質(zhì)量預(yù)處理。質(zhì)量預(yù)處理參數(shù)為質(zhì)量閾值２０邋（錯(cuò)誤率＝１％）、長(zhǎng)度閾值３５ｂｐ、窗口逡逑大�。保板澹猓稹ｅ义希保玻义�

（ＫＯＧ）進(jìn)行邋Ｂｌａｓｔ邋（Ｂａｓｉｃ邋Ｌｏｃａｌ邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋Ｓｅａｒｃｈ邋Ｔｏｏｌ）比對(duì)（取相似度＞３０％，且逡逑ｅ＜ｌｅ－５的注釋?zhuān)@得Ａｌｌ－ｉｍｉｇｅｎｅ的蛋白注釋詳細(xì)信息�；虻纳镄畔⒆⑨屃鞒倘珏义蠄D２－３所示。逡逑＊－邋Ｒａｗ邋ｄａｔａ逡逑；二；逡逑邐邐＊——＾逡逑Ｃｌｅａｎ逡逑ＮＯ邋－邋ＱＣ邐ｉ邐．逡逑；Ｇｅｎｏｍｅ邋ａｌ＾ｎｍｅｎｔ逡逑Ｙ邐ｊ邋ｖｉｓｉＭｌｕａｌｉｏｎ逡逑Ｉ邋ＡＪｉｊｎｍ？ｎｌ邋ｗｉｔｈ邐／邐邐逡逑ｔｅｎｅ／＊＊？ｏｍ＊邋邐邐邋－－邋－邐－邐＾邋Ｍａｐ邋ｒａｔｅ邋ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ逡逑｜邋ｒｅｌｅｒｅｎｃｅ逡逑Ｊ邋Ｄｉｉｔｎｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑Ｎ0邐ｒｅａｄ＊邋ｏｎ邋ｇｅｎｅ逡逑邐＂＂邋ＱＣ邋ｏｆ邋ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋＇邋＾逡逑ＣＭ）＊）邐Ｔｒａｍｏｒｔｐｌ邐Ｇｅｏ？邐Ａｌｔｅｍｉｔｉｖｃ邋Ｎｏｖｅｌ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ邋Ｇｅｎｒ邋Ｕｒｕｃｔｕｒｅ邐ｆ邐Ｇｅｒｘ－邋ｌｕｔｉｏｎ逡逑９Ｋｐｒｒ＼％ｉ0ｎ邋ｃｘｐｒｅ？？ｏｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邐？ｐｉ？ｄｎｆ邐ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邐ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ邐ａ0ａ邋￥邋ｎ邋ａ，Ｕ邋＾１＇邋ａｎａ？ｙ？ｔ（ｊｔｆｓｔ邋ｌ0ｆ逡逑邐邋邐邐１邐邋邐

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2725327