【摘要】：玉米大斑病(Exserohilum turcicum)是一種主要的世界性病害,嚴重爆發(fā)地區(qū)的感病品種減產(chǎn)可達50%左右,種植抗病品種是防治大斑病最經(jīng)濟、有效的措施。為培育抗病新品種,篩選鑒定抗病相關(guān)基因已成為有效防控玉米大斑病的重要研究任務(wù)。所以從基因水平上揭示玉米在大斑病菌侵染過程中可能參與抗病反應(yīng)的相關(guān)基因并對抗病相關(guān)基因進行克隆與功能分析,可為抗病分子育種提供科學依據(jù)及優(yōu)良的抗病基因資源。楊樹灰斑病(Phyllosticta populea Sacc)是楊樹主要病害之一,發(fā)生面積大且危害嚴重,目前已成為楊樹人工林急待解決的問題。種植抗病品種是防治楊樹灰斑病的最安全、有效的措施,但因抗病種質(zhì)資源匾乏,極大地阻礙了楊樹抗病品種的選育。楊樹作為轉(zhuǎn)基因的木本模式植物,采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源抗病基因轉(zhuǎn)入其基因組中是防治楊樹灰斑病行之有效的方法。病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein,PRP)是植物在病原物入侵等逆境脅迫過程中誘導表達的一類蛋白質(zhì),其功能大多與植物抗病反應(yīng)密切相關(guān)。隨著對其生化性質(zhì)、作用機理、表達調(diào)控的深入研究,用病程相關(guān)蛋白基因轉(zhuǎn)化植株日益成為植物防御病害的有效途徑。本研究以抗病玉米自交系C103HtN為植物材料,采用RNA-seq測序技術(shù),構(gòu)建玉米響應(yīng)大斑病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組文庫。對差異表達基因進行分析,篩選抗病相關(guān)基因;并對差異表達病程相關(guān)蛋白ZmPR-1和ZmPR-4基因進行克隆與功能分析,明確它們在抗玉米大斑病、楊樹灰斑病反應(yīng)中的作用,探索病程相關(guān)蛋白ZmPR-1、ZmPR-4基因的功能特性。這將進一步豐富病程相關(guān)蛋白與植物抗病關(guān)系的研究,同時也為利用植物基因工程防治植物病害的新途徑提供理論依據(jù)及優(yōu)良的抗病基因資源。研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了 9個大斑病菌誘導下玉米轉(zhuǎn)錄組文庫,共獲得差異表達基因5903個,其中有3195個基因上調(diào)表達,2708個基因下調(diào)表達。差異表達基因GO和KEGG功能顯著性富集分析結(jié)果顯示:與玉米抗逆響應(yīng)關(guān)系密切的主要有乙烯代謝途徑(ethylene metabolic process)GO:0009692、誘導系統(tǒng)抗性/茉莉酸介導的信號通路(induced systemic resistance/jasmonic acid mediated signaling pathway)G0:0009864、水楊酸介導的信號傳導途徑(salicylic acid mediated signaling pathway)G0:0009863、MAPK 信號通路(MAPK signaling pathway)ko04010、植物-病原體相互作用(Plant-pathogen interaction)ko04626等。并對植物與病原相互作用的基因、植物抗逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、植物激素相關(guān)基因和植物抗氧相關(guān)基因四類差異表達基因進行了表達模式分析。由此可見,大斑病菌誘發(fā)了玉米多種抗病信號通路及信號傳導途徑,暗示玉米響應(yīng)大斑病菌侵染的分子機制受到多基因網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的調(diào)控。隨機選擇8個差異表達基因進行qRT-PCR驗證,結(jié)果證明Illumina RNA-Seq測序結(jié)果是可靠的。(2)通過基因差異表達分析,從中篩選了一個PR-1基因進行克隆及功能分析。ZmPR-1基因cDNA全長開放閱讀框為504bp,編碼167氨基酸,ZmPR-1蛋白具有PR-1基因家族完整的SCP超家族保守結(jié)構(gòu)域,同多種植物的PR1蛋白同源性極高。干旱、鹽、大斑病菌及其代謝物均可顯著誘導該基因表達。構(gòu)建植物表達載體,對其進行煙草轉(zhuǎn)化,獲得14株陽性株系。陽性株系抗病性測定結(jié)果顯示:ZmPR-1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達可提高其對玉米大斑病菌的抗性�？剐灾晗禑煵萑~片防御酶活性的測定結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因煙草在玉米大斑病菌脅迫下其超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性均顯著提高。初步明確ZmPR-1基因具有抗玉米大斑病菌的功能。(3)通過基因差異表達分析,從中篩選了一個PR-4基因進行克隆及功能分析。ZmPR-4基因cDNA全長開放閱讀框為492bp,編碼163氨基酸,并在23和24個氨基酸之間有一個明顯的信號肽結(jié)構(gòu)。干旱、鹽、大斑病菌及其代謝物均可顯著誘導該基因表達。構(gòu)建植物表達載體,對其進行煙草轉(zhuǎn)化,獲得7株陽性株系。陽性株系抗病性測定結(jié)果顯示:玉米ZmPR-4基因在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達可提高其對玉米大斑病菌的抗性�？剐灾晗禑煵萑~片防御酶活性的測定結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因煙草在玉米大斑病菌脅迫下其SOD、POD和CAT活性均顯著提高。初步明確ZmPR-4基因具有玉米抗大斑病菌的功能。(4)ZmPR1和ZwPR4基因在煙草中過量表達均提高了轉(zhuǎn)基因株系對楊樹灰斑病菌(P.populea Sacc)的抗病性。對抗性株系煙草葉片防御酶活性、總酚含量和丙二醛(MDA)含量進行測定,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草Nu-ZmPR-1、Nu-ZmPR-4在楊樹灰斑病菌脅迫下顯著提高了苯丙氨酸解氨酶(PAL)、POD、SOD和CAT活性,提高了總酚含量,而降低了 MDA含量。初步明確ZwPR-1、ZmPR-4基因?qū)顦浠野卟【哂幸欢ǖ目剐浴?br> 【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.131;S763.7
【圖文】：

２．２．３大斑病菌誘導玉米轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及測序逡逑９個樣本的ｃＤＮＡ文庫構(gòu)建及測序均由上海生工生物工程股份有限公司完成，具體逡逑構(gòu)建及測序流程如圖２－１所示。采用Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋ＨｉＳｅｑ？邋２５００測序平臺對構(gòu)建的玉米轉(zhuǎn)錄逡逑組文庫進行測序，鑒于數(shù)據(jù)錯誤率對結(jié)果的影響，采用軟件ｃｕｔａｄａｐｔ對原始數(shù)據(jù)進逡逑行質(zhì)量預處理。質(zhì)量預處理參數(shù)為質(zhì)量閾值２０邋（錯誤率＝１％）、長度閾值３５ｂｐ、窗口逡逑大�。保板澹猓�。逡逑－１２－逡逑

（ＫＯＧ）進行邋Ｂｌａｓｔ邋（Ｂａｓｉｃ邋Ｌｏｃａｌ邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋Ｓｅａｒｃｈ邋Ｔｏｏｌ）比對（取相似度＞３０％，且逡逑ｅ＜ｌｅ－５的注釋），獲得Ａｌｌ－ｉｍｉｇｅｎｅ的蛋白注釋詳細信息�；虻纳镄畔⒆⑨屃鞒倘珏义蠄D２－３所示。逡逑＊－邋Ｒａｗ邋ｄａｔａ逡逑；二；逡逑邐邐＊——＾逡逑Ｃｌｅａｎ逡逑ＮＯ邋－邋ＱＣ邐ｉ邐．逡逑；Ｇｅｎｏｍｅ邋ａｌ＾ｎｍｅｎｔ逡逑Ｙ邐ｊ邋ｖｉｓｉＭｌｕａｌｉｏｎ逡逑Ｉ邋ＡＪｉｊｎｍ？ｎｌ邋ｗｉｔｈ邐／邐邐逡逑ｔｅｎｅ／＊＊？ｏｍ＊邋邐邐邋－－邋－邐－邐＾邋Ｍａｐ邋ｒａｔｅ邋ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ逡逑｜邋ｒｅｌｅｒｅｎｃｅ逡逑Ｊ邋Ｄｉｉｔｎｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑Ｎ0邐ｒｅａｄ＊邋ｏｎ邋ｇｅｎｅ逡逑邐＂＂邋ＱＣ邋ｏｆ邋ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋＇邋＾逡逑ＣＭ）＊）邐Ｔｒａｍｏｒｔｐｌ邐Ｇｅｏ？邐Ａｌｔｅｍｉｔｉｖｃ邋Ｎｏｖｅｌ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ邋Ｇｅｎｒ邋Ｕｒｕｃｔｕｒｅ邐ｆ邐Ｇｅｒｘ－邋ｌｕｔｉｏｎ逡逑９Ｋｐｒｒ＼％ｉ0ｎ邋ｃｘｐｒｅ？？ｏｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邐？ｐｉ？ｄｎｆ邐ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邐ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ邐ａ0ａ邋￥邋ｎ邋ａ，Ｕ邋＾１＇邋ａｎａ？ｙ？ｔ（ｊｔｆｓｔ邋ｌ0ｆ逡逑邐邋邐邐１邐邋邐

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 游瑋;杜正芹;;楊樹灰斑病與褐斑病的發(fā)生與防治[J];現(xiàn)代農(nóng)村科技;2014年11期

2 劉瑩;;5種藥用植物提取液對楊樹灰斑病抑菌活性研究[J];遼寧林業(yè)科技;2012年03期

3 侯麗霞;高超;車永梅;趙方貴;劉新;;葡萄病程相關(guān)蛋白1基因的克隆和表達分析[J];植物生理學報;2012年01期

4 李延海;;楊樹灰斑病的發(fā)生與防治[J];現(xiàn)代化農(nóng)業(yè);2009年03期

5 李佳;鄭清川;杜林方;;煙草病程相關(guān)蛋白PR-1a的三維模型和熒光光譜[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學報;2008年04期

6 趙小虎;陳翠蓮;焦春香;甘莉;魯劍巍;;不同油菜品種對油菜菌核病敏感性差異的生理生化特性研究[J];華中農(nóng)業(yè)大學學報;2006年05期

7 王彥華;侯喜林;申書興;;白菜病程相關(guān)蛋白1基因cDNA全長的克隆與分析[J];園藝學報;2006年05期

8 翟彩霞,馬春紅,王立安,陳霞,郭秀林,崔四平,李廣敏;玉米在誘導抗病過程中丙二醛(MDA)含量的變化[J];玉米科學;2005年01期

9 袁慶華,桂枝,張文淑;苜�？垢泻职卟∑贩N內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化物酶和多酚氧化酶活性的比較[J];草業(yè)學報;2002年02期

10 歐陽石文,馮蘭香,趙開軍;植物幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白及幾丁質(zhì)結(jié)合域特征和作用[J];生命科學;2002年02期

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1 陳全助;福建桉樹焦枯病菌鑒定及其誘導下桉樹轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學研究[D];福建農(nóng)林大學;2013年

2 黃秀麗;玉米彎孢菌葉斑病抗性相關(guān)蛋白質(zhì)鑒定及功能研究[D];上海交通大學;2009年

3 崔素萍;小麥受條銹菌侵染后防衛(wèi)基因的表達特征及其克隆[D];西北農(nóng)林科技大學;2005年

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1 謝樹章;蠟梅（Chimonanthus praecox （L.）Link）幾丁質(zhì)酶基因Cpchia的克隆及原核表達產(chǎn)物特性分析[D];西南大學;2009年

本文編號：2725327