【摘要】：摘要:沙棘木蠹蛾Eogystia hippophaecolus是中國(guó)沙棘林危害最嚴(yán)重的鉆蛀性害蟲(chóng),嚴(yán)重影響了沙棘栽種區(qū)的生態(tài)環(huán)境和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。沙棘木蠹蛾主要以幼蟲(chóng)在沙棘根部越冬,其分布區(qū)覆蓋我國(guó)東北、華北和西北大部分地區(qū),幼蟲(chóng)對(duì)低溫適應(yīng)的能力非常強(qiáng)�；跓峒さ鞍�(HSPs)可以在低溫下修復(fù)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì),從而防止細(xì)胞損傷和改善耐受性等特點(diǎn),本文研究了沙棘木蠹蛾幼蟲(chóng)3種熱激蛋白基因的序列特征和表達(dá)規(guī)律,并通過(guò)原核表達(dá)和免疫印跡試驗(yàn)從蛋白層面研究其表達(dá)特點(diǎn)及驗(yàn)證所獲得蛋白的表達(dá)正確性。在已獲得沙棘木蠹蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,篩選出3種熱激蛋白基因,分別為HSP19.7、HSP19.9、HSP70,驗(yàn)證3種基因分別為全長(zhǎng)基因;用克隆技術(shù)獲得其開(kāi)放閱讀框(open read frame,ORF)全長(zhǎng)序列并分析其生物信息學(xué)特征;運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)探尋3種熱激蛋白基因在幼蟲(chóng)受到冷刺激時(shí)不同組織以及冷刺激后不同恢復(fù)時(shí)間的表達(dá)規(guī)律;將全長(zhǎng)擴(kuò)增后測(cè)序驗(yàn)證正確的3種熱激蛋白基因通過(guò)雙酶切連接至表達(dá)載體pET-30a(+)上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行原核表達(dá),通過(guò)免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)3種沙棘木蠹蛾熱激蛋白。結(jié)果如下:1.獲得了 3條HSP基因的完整cDNA開(kāi)放閱讀框堿基和氨基酸序列。HSP19.7基因全長(zhǎng)ORF為510bp,基因編碼169個(gè)氨基酸,19.67kDa的分子量;HSP19.9基因全長(zhǎng)540bp,編碼179個(gè)氨基酸,19.9kDa的分子量;HSP70基因全長(zhǎng)1896bp,編碼631個(gè)氨基酸,69.7kDa的分子量。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,在3種HSPs氨基酸序列中都發(fā)現(xiàn)典型的熱激蛋白分子家族結(jié)構(gòu)特征,其中在HSP70氨基酸序列中找到3個(gè)HSP70 家族的簽名序列(IFDLGGGTFDVSIL、VVLVGGSTRIPKVQS、IDLGTTYS)及胞質(zhì)特征序列(EEVD),并分別命名為Eh-HSP19.7、Eh-HSP19.9和Eh-HSP70。多序列比對(duì)結(jié)果表明3種熱激蛋白與多種鱗翅目昆蟲(chóng)的熱激蛋白序列含有較高同源性。2.明確了冷刺激后沙棘木蠹蛾4種組織內(nèi)3種HSPs的表達(dá)規(guī)律。在25℃常溫環(huán)境下,沙棘木蠹蛾幼蟲(chóng)的3種HSPs在4個(gè)組織間均沒(méi)有明顯表達(dá)差異。經(jīng)-5℃低溫處理的幼蟲(chóng)體內(nèi),表皮的熱激蛋白基因表達(dá)量相比未處理的表達(dá)量明顯上調(diào),具有顯著差異。結(jié)果證明低溫刺激可以促使3種熱激蛋白基因在不同組織中上調(diào)表達(dá),而表皮是應(yīng)激反應(yīng)最為活躍的部位。在冷刺激下,sHSPs在脂肪體中也表現(xiàn)出強(qiáng)烈的反應(yīng)。3.明確了冷刺激后的恢復(fù)期內(nèi)沙棘木蠹蛾3種HSPs的表達(dá)規(guī)律。冷刺激后不同恢復(fù)時(shí)間的3種HSPs在各階段都有表達(dá),表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢(shì),且在恢復(fù)1-2小時(shí)階段會(huì)分別達(dá)到峰值,此時(shí)和未處理幼蟲(chóng)的表達(dá)量存在顯著差異。結(jié)果證明昆蟲(chóng)在接受低溫刺激后,轉(zhuǎn)入相比于該溫度更高的正常環(huán)境溫度,HSPs會(huì)先上調(diào),而后由于自身調(diào)節(jié)會(huì)恢復(fù)正常生長(zhǎng)發(fā)育情況下的表達(dá)量,這也反映了昆蟲(chóng)的自我調(diào)節(jié)能力以及低溫刺激后的恢復(fù)過(guò)程有HSPs參與。4.證明了本實(shí)驗(yàn)獲得的3種HSPs已經(jīng)準(zhǔn)確表達(dá)。進(jìn)一步將3種熱激蛋白分別連接表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)出成功表達(dá)的重組蛋白。用SDS-PAGE檢測(cè)出3種熱激蛋白均高效表達(dá),并與預(yù)測(cè)的重組蛋白分子量相一致。利用制備的多克隆抗體對(duì)沙棘木蠹蛾幼蟲(chóng)HSPs蛋白進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn),結(jié)果表明3種熱激蛋白能夠準(zhǔn)確表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S763.7
【圖文】：

圖１－１技術(shù)路線圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ邋ｒｏａｄｍａｐ逡逑

０邋１００逡逑圖３－３沙棘木蠹ＨＳＰ１９．７氨基酸序列結(jié)構(gòu)。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－３邋Ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＨＳＰ１９．７邋ｏｆ邋Ｅｏｇｙｓｔｉａ邋ｈｉｐｐｏｐｈａｅｃｏｌｕｓ逡逑：，＂＂ 逡逑Ｐｆａｍ逡逑■邋？邋＿Ｐ２0逡逑ｍｍ邐—＿逡逑Ｍｉｌｌ——逡逑０邋１００逡逑圖３－４沙棘木

本文編號(hào)：2724742