【摘要】：根結(jié)線蟲屬于專性活體寄生病原物,每年危害5500多種作物,如辣椒和番茄等,會在世界范圍內(nèi)造成巨大的的經(jīng)濟損失。目前,防治根結(jié)線蟲的措施大多以化學(xué)防治為主,生物防治為輔,對環(huán)境和人類健康危害較大,且增加生產(chǎn)成本。遵辣1號和CM334辣椒基因組的發(fā)表為辣椒基因分析提供了一種新工具。雖然在辣椒中找到了許多抗線蟲基因,但是很少有抗線蟲基因被精細定位及克隆。辣椒抗根結(jié)線蟲Me3基因不僅能對南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲有廣譜抗性,還能在高溫條件下保持活性,因此,Me3基因可以作為一種優(yōu)勢的抗性基因資源被發(fā)掘。本實驗結(jié)合基因組數(shù)據(jù)分析結(jié)果,利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)和Indel分子標(biāo)記技術(shù),在辣椒9號染色體上6 Mb大小的區(qū)間內(nèi)開發(fā)了559個分子標(biāo)記。首先在親本和抗感池間篩選具有明顯差異的分子標(biāo)記,進而利用這些標(biāo)記進行Me3基因的精細定位,確定Me3基因的候選區(qū)間。選取遺傳距離與Me3基因最近的一個Indel分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化成更加穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上,以遵辣1號的基因組序列為參考,設(shè)計多對引物,分段擴增了Me3候選基因Capana09g000159基因的DNA序列和CDS序列。具體實驗結(jié)果如下:1.利用SSR標(biāo)記和Indel標(biāo)記繪制精細定位圖譜,篩選重組單株。通過篩選遵辣1號P9染色體上6 Mb大小區(qū)間內(nèi)的SSR和Indel標(biāo)記,確定7個與Me3基因連鎖的精細定位標(biāo)記,并用JoinMap 4.0軟件繪制遺傳圖譜,結(jié)果顯示,Me3基因位于Indel537標(biāo)記和SSR381標(biāo)記之間,且Indel537標(biāo)記與Me3基因遺傳距離最近,為0.5 cM。2.基于Indel537標(biāo)記的測序結(jié)果,設(shè)計共顯性分子標(biāo)記SCAR537,用來鑒定待測辣椒植株是否具有根結(jié)線蟲抗性。經(jīng)PCR擴增后,實驗結(jié)果可在瓊脂糖凝膠電泳上檢測,操作更加方便快捷。該標(biāo)記在54株HDA149×茄門的F2代群體中的擴增結(jié)果和抗性鑒定結(jié)果完全一致,進一步說明該標(biāo)記可用來鑒定待測辣椒植株是否根結(jié)線蟲抗性。3.根據(jù)遵辣1號基因組序列,在抗病父本HDA149和感病母本8214中,克隆了Capana09g000159基因的DNA序列和cDNA序列。序列比對結(jié)果顯示,抗病品種和感病品種之間確實存在多個SNP和插入缺失位點,這些突變導(dǎo)致了氨基酸序列的改變,并且與辣椒抗根結(jié)線蟲特性相關(guān)。4.在前人的基礎(chǔ)上,重新構(gòu)建了Capana09g000163和Capana09g000164基因的TRV沉默載體,實驗結(jié)果表明,Capana09g000163基因的沉默會對辣椒抗性有一定的影響,但是效果不明顯。綜上所述,本研究通過BSA法對辣椒抗感池進行了重測序,及F_2代大群體的表型鑒定,結(jié)合公布的遵辣1號基因組,設(shè)計得到了多個與Me3基因連鎖的分子標(biāo)記,并開發(fā)出一個與之緊密連鎖的SCAR標(biāo)記,不僅加速了分子標(biāo)記輔助育種進程,也為Me3基因的精細定位及克隆打下了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S436.418.1
【圖文】：

1.1.1 根結(jié)線蟲的生物學(xué)特性根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)是一種專性內(nèi)寄生性線蟲，寄主范圍十分廣泛，每年會危害多種作物，造成嚴重的經(jīng)濟損失（Jones et al., 2013）。根結(jié)線蟲體型呈長管狀，無脊椎，長小于 2 mm，屬于線蟲動物門（Nematoda），側(cè)尾腺綱（Secernentea），墊刃目（Tylench異皮線蟲科（Heteroderidae），根結(jié)亞科（Meloidogyninae），根結(jié)線蟲屬（Meloidogyne）。結(jié)線蟲（M. incognita）寄主最廣泛，可以侵染 1700 多種作物。此外，北方根結(jié)線蟲（M. h花生根結(jié)線蟲（M. arenaria），以及爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）也是危害嚴重的主要線（Huang et al., 2016; Naz et al., 2013）。植物患上根結(jié)線蟲病的典型特征是寄主植物根部有根結(jié)形成，根結(jié)中通常含有不同齡結(jié)線蟲以及富含植物核酸、蛋白質(zhì)的巨型細胞(Triantaphyllou and Hirschmann, 1960)。根結(jié)生活史與植物根結(jié)的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)（圖 1.1）。根結(jié)線蟲的卵通常粘附在根的表面，由膠狀包裹，胚胎在卵內(nèi)經(jīng)歷第一次蛻皮形成二齡幼蟲（J2s），并用口針穿根部細胞壁，同時分素酶和果膠酶，從根尖伸長區(qū)侵入植物根部。刺激寄主細胞形成由 2-12 個巨型細胞組成的點，為線蟲代謝提供營養(yǎng)，從而使得根部組織增生形成根結(jié)，嚴重危害根部的輸導(dǎo)組織（PeMoens, 2006）。巨型細胞的存活依賴于線蟲的不斷刺激，當(dāng)線蟲死亡后，巨型細胞隨之死

圖 2.1 HDA149（A）和遵辣 1 號（B）對南方線蟲抗性鑒定結(jié)果Fig 2.1 The identification of HDA149 (A) and Zunla-1 (B) to M. incognita選 HDA149 和遵辣 1 號各 15 株長勢相近的幼苗，每株接種 Me3 毒性性。結(jié)果顯示：HDA149 的平均根結(jié)數(shù)為 35.0 個，平均卵塊數(shù)為 42.數(shù)為 16.3 個，平均卵塊數(shù)為 3.8 個（圖 2.2）。遵辣 1 號的平均根結(jié)數(shù)9 有顯著差異（P < 0.1）。由于 HDA149 中僅含 Me3 抗線蟲基因，故其而毒性線蟲雖然可侵染遵辣 1 號，但致病力明顯小于 HDA149，故而能含有其它抗線蟲基因（圖 2.3）。圖 2.2 HDA149 和遵辣 1 號對 Me3 毒性線蟲抗性鑒定結(jié)果

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