【摘要】：維持生物體正常生命活動(dòng)的生化反應(yīng)有很多種,其中氧化還原反應(yīng)是最為基礎(chǔ)和重要的反應(yīng),催化該反應(yīng)高效進(jìn)行的酶類(lèi)統(tǒng)稱(chēng)為氧化還原酶。氧化還原酶在生物體內(nèi)具有多種生理功能,包括通過(guò)催化反應(yīng)為機(jī)體提供能量、清除多余有害物質(zhì)、活化大分子物質(zhì)等。根據(jù)不同的氨基酸結(jié)構(gòu)和涉及在不同生理活動(dòng)中的活性,可以將氧化還原酶劃分為很多種類(lèi)型,其中葡萄糖氧化酶與過(guò)氧化物酶均是廣泛存在于植物、動(dòng)物與微生物體內(nèi)的,具有抗氧化功能的氧化還原酶。葡萄糖氧化酶(GOX)是一種需氧脫氫酶,具有對(duì)β-D-吡喃葡萄糖特異性識(shí)別的特點(diǎn),其功能是作為抗氧化劑降低生物體內(nèi)的氧濃度,維持生物的正常生理活動(dòng);為厭氧菌創(chuàng)造有益環(huán)境,抑制有害菌的生長(zhǎng)等。過(guò)氧化物酶(POD)是抗氧化酶系統(tǒng)主要組成酶中的一員,其功能是清除生物體內(nèi)多余的活性氧,防止生物體內(nèi)由于活性氧過(guò)多而引起一系列的氧化損傷,如破壞大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)、酶失活、脂質(zhì)過(guò)氧化等。黏蟲(chóng)Mythimna separata是我國(guó)糧食作物上的重大農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)之一,具有暴食性和季節(jié)性長(zhǎng)距離遷飛等為害特征,嚴(yán)重威脅糧食生產(chǎn)安全。其發(fā)生危害有以下幾個(gè)特點(diǎn):發(fā)生范圍廣,危害世代多;危害作物的種類(lèi)和數(shù)量多;暴發(fā)性明顯,可產(chǎn)生嚴(yán)重的產(chǎn)量損失;發(fā)生危害歷史長(zhǎng)等。目前對(duì)于黏蟲(chóng)GOX與POD基因的研究仍處于初級(jí)階段,根據(jù)GOX與POD參與的氧化還原作用機(jī)制以及已知的昆蟲(chóng)GOX與POD的相關(guān)研究,猜想這兩種酶參與的抗氧化酶系統(tǒng)是否與昆蟲(chóng)的消化作用、抑菌作用及受到逆境產(chǎn)生的保護(hù)性作用有關(guān),進(jìn)而可以利用RNAi技術(shù)沉默基因,使其功能受到影響,抑制昆蟲(chóng)的生理代謝活動(dòng)從而達(dá)到利用生物技術(shù)防治害蟲(chóng)的目的。本試驗(yàn)以黏蟲(chóng)為供試材料,克隆獲得兩條全新的黏蟲(chóng)葡萄糖氧化酶基因MsGOX和過(guò)氧化物酶基因MsPOD的cDNA序列;分別對(duì)其核苷酸序列與氨基酸序列進(jìn)行分析;研究在不同組織與不同齡期中兩種基因時(shí)空表達(dá)水平的差異性;對(duì)黏蟲(chóng)進(jìn)行不同濃度葡萄糖誘導(dǎo)處理和饑餓與復(fù)喂處理來(lái)探究MsGOX基因在昆蟲(chóng)取食方面發(fā)揮的作用;對(duì)黏蟲(chóng)進(jìn)行不同時(shí)間不同溫度的處理,探究MsPOD基因在受到極端溫度誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生的昆蟲(chóng)保護(hù)性作用;利用RNAi技術(shù)探究MsGOX基因沉默后對(duì)黏蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育造成的影響,探究MsGOX基因沉默后對(duì)該基因抑菌作用的影響以及對(duì)蘇云金芽孢桿菌侵染增效的作用,為利用該基因進(jìn)行分子設(shè)計(jì)來(lái)防治黏蟲(chóng)奠定理論基礎(chǔ)。主要試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)如下:1.克隆獲得一條新的黏蟲(chóng)GOX基因cDNA序列,該基因命名為MsGOX,基因登錄號(hào)為KY348779。cDNA序列全長(zhǎng)2187 bp,包含1個(gè)長(zhǎng)度為1821 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼含有606個(gè)氨基酸的多肽,其分子量為66.4 ku,等電點(diǎn)為4.79。氨基酸序列分析顯示該基因編碼的氨基酸屬于GMC家族,包括兩個(gè)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域GMC_oxred_N和GMC_oxred_C,氨基酸序列與鱗翅目夜蛾科其他昆蟲(chóng)氨基酸序列親緣關(guān)系較近,與棉鈴蟲(chóng)、甜菜夜蛾、谷實(shí)夜蛾和苜蓿夜蛾的一致性較高,達(dá)85%以上�？寺～@得一條新的黏蟲(chóng)POD基因cDNA序列,該基因命名為MsPOD,基因登錄號(hào)MH606240。cDNA序列全長(zhǎng)2433 bp,包含1個(gè)長(zhǎng)度為2061 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼686個(gè)氨基酸組成的多肽,其分子量為76.1 ku,等電點(diǎn)為5.68。氨基酸序列分析顯示該基因編碼的氨基酸具有一個(gè)HPXs細(xì)胞粘附蛋白結(jié)構(gòu)域,屬于過(guò)氧化物酶一環(huán)氧酶超家族,氨基酸序列比對(duì)顯示,MsPOD的氨基酸序列與鱗翅目夜蛾科其他昆蟲(chóng)氨基酸序列親緣關(guān)系較近,其中與棉鈴蟲(chóng)POD氨基酸序列同源性最高,為92%。2.探究MsGOX基因與MsPOD基因時(shí)空表達(dá)差異,分析在不同發(fā)育階段與不同組織中不同基因在蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)水平的變化情況。經(jīng)試驗(yàn)及分析發(fā)現(xiàn)MsGOX基因在黏蟲(chóng)不同發(fā)育階段與檢測(cè)的不同組織中均有表達(dá),其中在4齡時(shí)期和唾腺中表達(dá)量最高,在1齡時(shí)期和前腸中表達(dá)量最低。MsPOD基因在不同發(fā)育階段和不同組織中也均有表達(dá),在蛹期和唾腺中表達(dá)量最高,在1齡時(shí)期和前腸中表達(dá)量最低。3.探究MsGOX基因與昆蟲(chóng)取食作用的關(guān)系。對(duì)黏蟲(chóng)進(jìn)行4種不同濃度葡萄糖溶液的處理,結(jié)果顯示4種濃度的葡萄糖溶液均能誘導(dǎo)MsGOX基因的表達(dá)水平,并且越高濃度的葡萄糖溶液對(duì)MsGOX基因的表達(dá)水平影響越大,在葡萄糖濃度為10%時(shí),該基因的表達(dá)水平達(dá)到最高;對(duì)黏蟲(chóng)進(jìn)行饑餓處理,結(jié)果表明隨著饑餓時(shí)間的增加,MsGOX基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì),在處理24 h時(shí)表達(dá)水平達(dá)到最高;同時(shí)饑餓處理的黏蟲(chóng)進(jìn)行復(fù)喂處理,結(jié)果表明MsGOX的表達(dá)水平有逐漸升高的趨勢(shì)。探究MsPOD基因受極端溫度誘導(dǎo)產(chǎn)生的昆蟲(chóng)保護(hù)性作用。對(duì)黏蟲(chóng)進(jìn)行不同溫度梯度與不同時(shí)間的處理,結(jié)果表明經(jīng)溫度梯度誘導(dǎo)后,MsPOD基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平具有顯著差異,在35℃高溫處理12 h后表達(dá)水平達(dá)到最高。4.探究MsGOX基因被干擾后對(duì)黏蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響。結(jié)果顯示黏蟲(chóng)的體重、體長(zhǎng)與消化系數(shù)均受到影響,在處理12 h后有明顯的抑制作用。探究MsGOX基因被干擾后對(duì)該基因抑菌作用的影響。結(jié)果顯示注射dsGOX的處理組黏蟲(chóng)中腸菌懸液制作的平板菌落數(shù)量大于注射dsEGFP的對(duì)照組黏蟲(chóng)中腸菌懸液制作的平板菌落數(shù)量,表明MsGOX基因的抑菌作用受到一定程度的抑制。探究MsGOX基因被干擾后對(duì)蘇云金芽孢桿菌侵染黏蟲(chóng)的增效作用。結(jié)果顯示進(jìn)行蘇云金芽孢桿菌侵染后,注射了dsGOX的處理組死亡率較注射了dsEGFP的對(duì)照組相比有所升高,說(shuō)明黏蟲(chóng)抵抗蘇云金芽孢桿菌的侵染能力在進(jìn)行基因沉默后有所降低,對(duì)Bt菌有一定的增效作用。以上試驗(yàn)結(jié)果證明利用RNAi方法成功抑制了MsGOX基因的表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)MsGOX基因可能在黏蟲(chóng)的中腸消化中起到某種作用。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S433.4
【圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位論文右，具有很好的穩(wěn)定性；最適溫度集中在 30-60 ℃；GOX 在固體酶制劑的狀態(tài)下于 0 ℃可穩(wěn)定存在 2 年左右[16-17]。1.1.2 GOX 的作用機(jī)理GOX 通常與 CAT 以及輔基 FAD 結(jié)合形成氧化還原酶系統(tǒng)，進(jìn)行催化氧化作用[18]。作用機(jī)理可以簡(jiǎn)單的概括為：β-D-葡萄糖分子通過(guò)輔酶 EFAD的作用生成 -D-葡萄糖酸內(nèi)酯，輔酶 EFAD得到 β-D-葡萄糖分子中的氫原子后被還原為 EFADH2，之后 -D-葡萄糖酸內(nèi)酯酸度緩釋水解成 D-葡萄糖酸，同時(shí) EFADH2再氧化為 EFAD，并生成 H2O2。由此反應(yīng)過(guò)程可以看出，GOX 催化的反應(yīng)產(chǎn)物同時(shí)也是生物體代謝反應(yīng)必不可少的底物，并伴隨著反應(yīng)過(guò)程中的能量傳遞。催化反應(yīng)過(guò)程如下（圖 1-1）。

前 言有一定的作用。Park 等[70]克隆了 10 條甜菜夜蛾 POD 基因（SePOX A-J），并研究了該系列基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞免疫反應(yīng)中的作用。見(jiàn)煜坤[71]克隆了褐飛虱 Nilaparvata lugens 過(guò)氧化物酶基因，研究表明該基因在褐飛虱生命活動(dòng)及生理代謝中起到重要作用，并且可能與褐飛虱的遺傳變異有關(guān)。1.4.2 昆蟲(chóng) POD 家族及相關(guān)功能Zamock 等[72]根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)與酶活性的不同，將 HPXs 分為四個(gè)超家族（圖 1-2）。

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