【摘要】：近年來,我國蔬菜產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展,但生產(chǎn)上病蟲害發(fā)生嚴(yán)重,這將長期制約著我國蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。丁香假單胞菌番茄變種(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000)所引發(fā)的番茄細(xì)菌性葉斑病,是園藝栽培中極易發(fā)生的活體營養(yǎng)型細(xì)菌病害。生產(chǎn)上高度依賴化學(xué)殺菌劑,給生態(tài)環(huán)境和食品安全造成嚴(yán)重威脅。深入研究植物對于PstDC3000的抗性機(jī)制能為建立抗病的方法提供新思路,新策略,因此具有重要的實際生產(chǎn)意義。NAC(NAM/ATAF/CUC)轉(zhuǎn)錄因子為植物六大轉(zhuǎn)錄家族成員之一,研究顯示NAC家族參與調(diào)控生長發(fā)育以及植物對病原菌侵染等生物脅迫的防御反應(yīng)相關(guān)進(jìn)程。本文以番茄為研究對象,研究了轉(zhuǎn)錄因子NAC29在番茄調(diào)控生長以及防御PstDC3000侵染中的作用及機(jī)制。所得主要研究結(jié)果如下:1.研究了番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員對Pst DC3000侵染的響應(yīng)。本章主要利用實驗室已有的轉(zhuǎn)錄組測序(RN A sequencing,RNA-Seq)數(shù)據(jù),對PstDC3000脅迫下的番茄NAC家族基因成員的響應(yīng)進(jìn)行分析。分析了 101個番茄NAC基因在接種PstDC3000后的相對表達(dá)強(qiáng)度,發(fā)現(xiàn)15個NAC基因在接種PstDC3000后顯著上調(diào)(上調(diào)倍數(shù)1.5-3750倍),對15個基因本底含量進(jìn)行分析,剔除含量過低的4個基因,最終明確11個上調(diào)表達(dá)基因。進(jìn)行實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)11 個基因均有明顯上調(diào)。其中,NAC29的相對表達(dá)量上升最大,高達(dá)22.9倍。為明確NAC29在植物細(xì)胞中的作用部位,對N AC29進(jìn)行了亞細(xì)胞定位試驗,結(jié)果表明N AC29定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中。2.在上一章分析番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員對Pst DC3000侵染的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)NAC29基因表達(dá)量受誘導(dǎo)表達(dá)量最高的基礎(chǔ)上,猜想轉(zhuǎn)錄因子NAC29參與番茄防御PstDC3000過程,且發(fā)揮重要作用。故本章將其作為研究對象,構(gòu)建并鑒定了番茄NAC29基因過表達(dá)植株,得到兩個上調(diào)近60倍的穩(wěn)定遺傳的純合株系 OE:NAC29-1,OE:NAC29-2。對過表達(dá)植株接種Pst DC3000,研究NAC29基因過表達(dá)對番茄植株防御Pst DC3000的影響。進(jìn)行細(xì)胞菌落計數(shù),相較于野生型,過表達(dá)株系OE:NAC29-1,OE:NAC29-2的PstDC3000生長量顯著下降,且光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)光化學(xué)效率(OPSⅡ)和臺盼藍(lán)染色結(jié)果與cfu測定結(jié)果一致,NAC29基因過表達(dá)后與野生型植株相比發(fā)病減輕。結(jié)果表明:NAC29基因過表達(dá)能顯著增強(qiáng)番茄植株對Pst DC3000的防御能力。3.在上一章明確了NAC29基因過表達(dá)能增強(qiáng)番茄植株對PstDC3000的防御能力的基礎(chǔ)上,本章研究番茄轉(zhuǎn)錄因子NAC29在防御PstDC3000的過程與抗性相關(guān)基因的關(guān)系,探究NAC29轉(zhuǎn)錄因子在提高番茄防御能力中的作用機(jī)制。為進(jìn)一步探究機(jī)理,篩選抗病相關(guān)基因的啟動子序列,在7個基因均含有識別位點,于是選擇了上調(diào)幅度大的MYB14(1個位點),識別位點較多的βCA3,GS2,Fd-GOGAT作為后續(xù)研究對象,通過qRT-PCR進(jìn)一步篩選,發(fā)現(xiàn)β型碳酸酐酶3基因(βCarbonic anhydrase3,βCA3)在過表達(dá)植株,以及接種Pst DC3000后均有顯著上調(diào)(接病后,βCA3基因表達(dá)量從野生型中的1383倍上調(diào)到過表達(dá)株系中的2523和2272倍)。隨后進(jìn)行凝膠遷移檢測(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)實驗,結(jié)果表明,NAC29可以與βCA3啟動子結(jié)合。通過染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗也同樣證明NAC29可以直接靶標(biāo)βCA3啟動子。隨后通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(Virus induced gene silence,VIGS)驗證βCA3在防御Pst DC3000中的作用,沉默βCA3,植株表現(xiàn)為更加感病,這與前人研究一致。結(jié)果表明:NAC29能特異性地識別βCA3啟動子序列,進(jìn)而調(diào)節(jié)βCA3的轉(zhuǎn)錄水平,提高βCA3的含量,最終導(dǎo)致番茄植株對PstDC3000的防御能力增強(qiáng)。4.在上一章實驗基礎(chǔ)上,發(fā)現(xiàn)植株生長表型有所變化,所以對其生長進(jìn)行監(jiān)測。NAC29基因過表達(dá)植株前期矮壯,后期長勢與野生型相近;NAC29基因過量表達(dá)能使葉片中干物質(zhì)量降低,果實中干物質(zhì)量增加,果實干物質(zhì)分配比重增加。結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子NAC29可以通過增加干物質(zhì)向果實的分配比重提高產(chǎn)量。
【圖文】：

浙江大學(xué)碩士論文邐引言逡逑體激酶（ｆｌｇ２２－ｉｎｄｕｃｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅ－ｌ，ｆ７？Ａ７）表達(dá)（Ｙｅｈｅ／ａ／．，２０１５）。一般逡逑說，，ＰＴＩ有助于植物的基礎(chǔ)抗性以及非特異的病原體抗性，ＥＴＩ則在專性寄生菌逡逑染起更重要的作用，與ＰＴＩ相比，ＥＴＩ反應(yīng)更強(qiáng)烈更持久，能引起超敏反應(yīng)逡逑（Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＨＲ）邋（Ｐｅｎｇ邋Ｗｇ／．，２０１８）（圖邋１．１）0逡逑ＰＡＭＰ－ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ邋ｉｍｍｕｎｉｔｙ邐Ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ邋ｉｍｍｕｎｉｔｙ逡逑＊Ｐ0Ｐ＊Ｍ逡逑

ｗ？ｒ？逡逑土２＾１邋—邐邐逡逑圖１．１植物防御信號的傳遞（Ｒａｍｉｒｅｚ－Ｐｒａｄｏ邋ｅ／邋ａ／．，２０１８邋）逡逑越來越多的證據(jù)表明改變參與ＰＴＩ和ＥＴ丨的轉(zhuǎn)錄下游的信號級聯(lián)需要一個分逡逑子組織高度多樣化植物細(xì)胞核。這個過程中起作用的因子包括轉(zhuǎn)錄因子（圖逡逑１．２）、長鏈非編碼ＲＮＡｓ邋（ＩｎｃＲＮＡｓ）、�。遥危粒箦澹ǎ螅遥危粒螅⒔M蛋白修飾、染色質(zhì)逡逑重塑和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體（Ｍａｃｈ，邋２０１７；邋Ｈｕａｎｇｄａ／．，邋２０１６；邋Ｒａｍｉｒｅｚ－Ｐｒａｄｏ邋Ｗａ／．，逡逑２０１８；邋Ｎｅｊａｔ邋ａｎｄ邋Ｍａｎｔｒｉ，邋２０１７）。其中轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境應(yīng)答過程中起著關(guān)鍵的逡逑調(diào)控作用。逡逑雪邐＾邋ＰＲＲ邋ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ逡逑ＰＲＲ＿邋ＭＡＭＰｓ邐ＭＡＰＫ邋ｃａｓｃａｄｅｓ逡逑成ｊ邐二／＾邐Ｃａ２＾邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ逡逑ＤＡＭＰＳ逡逑４邋—邋卜邐？邋ＲＯＳ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑＼＼＼＼＼＼邐ＥＴ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑ＳＡ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑Ｃａｌｌｏｓｅ邋ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ逡逑＾邋Ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ逡逑ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑圖１．２轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控植物ＰＴＩ信號傳導(dǎo)和輸出ＴＦ：轉(zhuǎn)錄因子（Ｌｉｅ／0／．，２０１６）逡逑７逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S436.412.1

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本文編號：2709539