【摘要】：光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)是林木蛀干害蟲之一,給世界林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的危害。為了深入了解光肩星天牛先天性免疫機(jī)制,本研究對前期克隆到的四跨膜蛋白AglaTSP參與光肩星天牛先天性免疫的作用進(jìn)行了初步鑒定。首先利用生物信息學(xué)方法分析光肩星天牛四跨膜蛋白AglaTSP的序列特征,再利用球孢白僵菌(Beauveria bassiana)孢子及孢子裂解物、蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)及其裂解物對光肩星天牛成蟲進(jìn)行免疫誘導(dǎo)后,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)、RNA干擾(RNA interference,RNAi)等技術(shù)檢測AglaTSP以及其他5種免疫相關(guān)蛋白基因的相對表達(dá)量以及酚氧化酶活性,同時(shí)監(jiān)測免疫干擾導(dǎo)致的試蟲活性變化,最后根據(jù)昆蟲免疫相關(guān)通路及實(shí)驗(yàn)結(jié)果模擬繪制AglaTSP參與的光肩星天牛免疫代謝通路流程圖。主要結(jié)果如下:(1)AglaTSP具有典型的四跨膜蛋白結(jié)構(gòu),包含有CCG(Cys-Cys-Gly)和GC保守序列。AglaTSP在進(jìn)化上相對保守,但與其它家族成員相比,相互之間序列相似度不高。Blastx分析發(fā)現(xiàn)AglaTSP屬于CD63亞家族。KEGG通路分析預(yù)測AglaTSP為CD63抗原,參與ko04142(溶酶體)途徑。(2)用四種免疫干擾劑對光肩星天牛成蟲進(jìn)行免疫誘導(dǎo),檢測AglaTSP基因表達(dá)量變化。與對照相比,24h內(nèi)AglaTSP基因相對表達(dá)量均有極顯著上調(diào)(P0.01),特別是經(jīng)球孢白僵菌孢子懸浮液干擾后6h,AglaTSP的基因表達(dá)量極顯著上調(diào)(P0.01),干擾18h后表達(dá)量上調(diào)至最高;白僵菌孢子裂解物免疫誘導(dǎo)試蟲6h后,AglaTSP基因表達(dá)量相對CK顯著增高(P0.05),18h后表達(dá)量極顯著增高(P0.01);蘇云金桿菌及菌裂解物免疫誘導(dǎo)12h后,AglaTSP基因相對表達(dá)量達(dá)極顯著上調(diào)(P0.01)。(3)根據(jù)AglaTSP基因序列特異性片段設(shè)計(jì)合成AglaTSP dsRNA,對光肩星天牛成蟲進(jìn)行RNAi 48h后,試蟲體內(nèi)AglaTSP基因的相對表達(dá)量出現(xiàn)極顯著下調(diào)(P0.01),到72h后RNAi沉默效率達(dá)到最高(沉默效率66.5%)。(4)利用四種免疫干擾劑分別對RNAi前后的光肩星天牛進(jìn)行免疫誘導(dǎo),監(jiān)測24h內(nèi)試蟲死亡率,結(jié)果表明,在24h內(nèi),未進(jìn)行RNAi的試蟲和RNAi后注射無菌水的試蟲死亡率均為0,而AglaTSP RNAi試蟲被免疫干擾劑干擾后,均有死亡現(xiàn)象:蘇云金桿菌免疫干擾RNAi試蟲,12h死亡率到達(dá)100%,裂解物干擾18h后試蟲死亡率達(dá)到100%;白僵菌孢子及孢子裂解物侵染24h后試蟲死亡率分別達(dá)到50%和40%。(5)以注射無菌水作為對照,免疫誘導(dǎo)AglaTSP RNAi和未經(jīng)RNAi的光肩星天牛,發(fā)現(xiàn)試蟲酚氧化酶活性發(fā)生顯著變化,未沉默AglaTSP的試蟲酚氧化酶活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,蘇云金桿菌及其裂解物誘導(dǎo)RNAi試蟲3h,酶活性達(dá)到極顯著增高(P0.01),隨后下調(diào),至12h酶活與對照無顯著差異(P0.01)。每組處理AglaTSP RNAi后光肩星天牛的酚氧化酶活性最高值均極顯著低于沒有進(jìn)行RNAi樣本的酶活最高值(P0.01),說明AglaTSP參與光肩星天牛免疫激活酚氧化酶原。利用qRT-PCR檢測AglaTSP RNAi前后光肩星天牛中相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果表明,RNAi AglaTSP基因表達(dá)對肽聚糖識別蛋白和β-1,3-葡聚糖識別蛋白的識別影響不顯著,其余三種功能蛋白基因的表達(dá)量極顯著低于未進(jìn)行RNAi的試蟲。AglaTSP在天牛免疫反應(yīng)中參與接受信號識別蛋白識別的“非己”物質(zhì)入侵信號,并將信號傳遞給信號調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白。(6)結(jié)合有五種蛋白參與的昆蟲免疫KEGG通路以及上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對AglaTSP的作用位點(diǎn)定位,繪制有四跨膜蛋白AglaTSP參與的光肩星天牛相關(guān)免疫通路,AglaTSP于信號識別分子及信號調(diào)制分子之間行使功能。綜上所述,四跨膜蛋白AglaTSP參與光肩星天牛先天性免疫調(diào)節(jié),將識別分子發(fā)出的入侵信號傳遞給信號調(diào)制分子。本研究對深入了解光肩星天牛應(yīng)對侵染的免疫分子機(jī)制和生態(tài)適應(yīng)機(jī)制具有重要意義,同時(shí)為天�？坪οx的無公害防治提出新的策略和靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

1.1.2 四跨膜蛋白功能研究進(jìn)展四跨膜蛋白特殊的蛋白結(jié)構(gòu)能夠使其作為通道連接細(xì)胞膜內(nèi)外信號，參與生物體的多種生命活動。1997 年，，四跨膜蛋白的功能首次被 Maecker 詮釋，隨后有關(guān)其功能的報(bào)道逐漸增多[15]。四跨膜蛋白分子能夠影響生物體磷酸肌醇依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而影響細(xì)胞生長、囊泡運(yùn)輸和許多細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[16]。如 CD37 可以直接參與導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]。CD63 在小鼠胚胎發(fā)育和著床過程中發(fā)揮重要作用[18]，小鼠四跨膜蛋白CD9 在卵細(xì)胞表面表達(dá)，對小鼠的精卵融合至關(guān)重要[19]。綿羊卵母細(xì)胞中的四跨膜蛋白 CD9 損傷會降低受精率[20,21]。線蟲（Caenorhabditis Elegans）四跨膜蛋白 TSP15是其蛻皮行為及表皮發(fā)育所必需的[22]，擬南芥（Arabidopsis thaliana）的 17 種四跨膜蛋白中，有多個(gè)與其生長發(fā)育有關(guān)[3]，香蕉四跨膜蛋白 MaTET 影響果實(shí)的成熟[23]。

免疫調(diào)節(jié)中擔(dān)任什么角色？它的作用機(jī)制是怎樣的？這些都需要進(jìn)行深入研究。本研究以光肩星天牛四跨膜蛋白 AglaTSP 為研究對象，利用生物信息學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）、RNA 干擾（RNAinterference, RNAi）等試驗(yàn)方法進(jìn)行光肩星天牛先天性免疫的相關(guān)探索，為深入解析光肩星天牛應(yīng)對病原菌侵染的免疫分子機(jī)制具有重要意義。技術(shù)路線：
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S763.38

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3 張波;徐慶林;;光肩星天牛白僵病的初步研究[A];中國蟲生真菌研究與應(yīng)用[C];1991年

4 秦

本文編號：2704145