【摘要】：家蠶(Bombyx mori)作為鱗翅目模式昆蟲,具有重要的經(jīng)濟和研究價值,與鱗翅目的其他成員一樣,家蠶具有先天免疫系統(tǒng),缺乏獲得性免疫系統(tǒng)。每年蠶病給我國蠶桑產業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,其中家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)引起的血液型膿病對養(yǎng)蠶業(yè)危害尤其嚴重,不僅降低了蠶絲的產量和質量,也不利于我國蠶桑產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此探究家蠶與BmNPV相互作用的分子機制,鑒定可與病毒相互作用的家蠶抗病毒蛋白,對該病的有效防控有重要作用。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是家蠶體內特異基因編碼產生的一類有免疫效應的小分子多肽,其氨基酸殘基數(shù)目小于100,是昆蟲體液免疫中重要的抗菌因子,具有分子質量小、熱穩(wěn)定性強、抗菌譜廣、無免疫原性、對高等動物正常細胞無毒等特點。已有研究表明家蠶抗菌肽具有廣譜抗菌性,但是否具有抗BmNPV的能力未見報道,故本研究以鑒定家蠶抗菌肽抗BmNPV能力和探究其抗性機制為目的進行了相關研究,并獲得以下研究成果:1.BmNPV病毒誘導上調表達的抗菌肽篩選本研究以家蠶BmNPV抗性品系871C為模型,通過轉錄組和蛋白組分析了在抗性品系中受BmNPV病毒感染上調表達的抗菌肽。其中轉錄組數(shù)據(jù)篩選出的抗菌肽基因有BmGloverin1(BmGlv1)、BmGloverin3(BmGlv3)、BmAttacin1(BmAtt1)、BmLebcin3(BmLeb3)、BmMoricin3(BmMor3)、BmCecropinB1(BmCecB1)、BmCecropinB2(BmCecB2)、BmCecropinB3(BmCecB3)和BmCecropinD1(BmCecD1);蛋白組數(shù)據(jù)篩選出的抗菌肽包括BmGlv1、BmGlv3、BmGlv4和BmCecD1。此外,通過蠶體水平和細胞水平進一步驗證,結果顯示:蠶體水平BmCecB2、BmCecD1、BmGlv3和BmLeb3的表達量在感染BmNPV后顯著上調;細胞水平BmCecB1、BmCecB2、BmCecD1、BmGlv3和BmLeb3的表達量在感染BmNPV后顯著上調。綜合轉錄組數(shù)據(jù)、蛋白組數(shù)據(jù)以及蠶體和細胞水平驗證結果,最終篩選出可能參與抗病毒通路的抗菌肽為BmCecB2、BmCecD1、BmGlv3和BmLeb3。2.抗菌肽抗BmNPV病毒能力的鑒定為了鑒定所篩選抗菌肽的抗BmNPV能力,首先對篩選出來的四個抗菌肽進行生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)四個抗菌肽均具有信號肽,不具有核定位信號。其次構建了四個抗菌肽的過表達載體pIZ/V5-His-BmGlv3、pIZ/V5-His-BmLeb3、pIZ/V5-His-BmCecB2和pIZ/V5-His-BmCecD1。在細胞水平過表達抗菌肽,TCID50、實時熒光定量PCR、流式細胞術檢測過表達抗菌肽對病毒復制增殖的影響,結果顯示與對照組相比,四個抗菌肽分子均降低了病毒感染率,但其降低程度有所差異,病毒增殖情況從強到弱排序為:空白對照組pIZ-BmLeb3組pIZ-BmCecB2組pIZ-BmGlv3組pIZ-BmCecD1組。本研究進一步鑒定了抗菌肽分子之間的劑量效應,與單獨過表達BmCecB2或BmGlv3組相比,共同過表達BmLeb3與BmCecB2、BmLeb3與BmGlv3實驗組增強了其抗病毒能力,表明了抗菌肽之間能夠協(xié)同增強抗病毒能力。為了鑒定抗菌肽在蠶體上的抗病毒能力,本研究利用桿狀病毒表達系統(tǒng)在蠶體上過表達四個抗菌肽基因。結果顯示,與細胞水平結果一致,過表達四個抗菌肽均抑制了BmNPV的增殖,BmCecD1抗BmNPV能力最強,而BmLeb3抗BmNPV能力最弱;與細胞水平結果不同的是,在蠶體上BmCecD1表現(xiàn)出與其他抗菌肽協(xié)同增強抗病毒的能力。進一步統(tǒng)計實驗組和對照組病蠶死亡情況發(fā)現(xiàn),抗菌肽的過表達顯著延遲了BmNPV感染后的幼蟲死亡時間。3.抗菌肽抗病毒機制初探綜合細胞和個體上抗菌肽抗病毒能力,選取代表不同類型且抗病毒能力最強的抗菌肽亞家族的抗菌肽BmCECD1和BmGLV3用于解析其抗病毒機制。本研究通過免疫熒光技術鑒定了抗菌肽BmCECD1和BmGLV3感染病毒前后的亞細胞定位特征。結果發(fā)現(xiàn),病毒感染后0~48 h兩個抗菌肽均定位于細胞質中,感染后72 h時皆有部分進入了細胞核中,感染后96 h時BmCECD1完全進入了核內,而BmGLV3只有一部分進入了核內,一部分仍然在細胞質中。因為抗菌肽不存在核定位信號,我們推測BmCECD1和BmGLV3的入核現(xiàn)象與其抗BmNPV機制有關。實時熒光定量PCR檢測不同時間點的BmCecD1和BmGlv3抗BmNPV情況發(fā)現(xiàn),從感染后48 h開始BmCecD1和BmGlv3均表現(xiàn)出了一定的抗病毒能力,在感染后72~96 h,實驗組中的病毒增殖被顯著抑制,且BmCecD1到感染晚期抑制病毒基因復制能力增強。為了進一步探究抗菌肽抗病毒機制,以BmCECD1和BmGLV3為誘餌蛋白通過免疫共沉淀和質譜分析,釣取了與其相互作用的蛋白。通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)BmNPV IE1與BmCECD1共定位于細胞核中,BmNPV DBP與BmGLV3共定位于細胞質中,且免疫共沉淀實驗再次驗證了BmNPV IE1與BmCECD1、BmNPV DBP與BmGLV3具有相互作用。結合BmNPV IE1蛋白和BmNPV DBP蛋白相關研究結果推測,BmCECD1可能通過和BmNPV IE1相互作用,抑制了病毒DNA復制,從而抑制病毒的增殖;BmGLV3可能通過與BmNPV DBP相互作用,抑制了病毒核衣殼及病毒發(fā)生基質的產生,從而抑制了病毒的增殖。
【圖文】：

圖 1.1 昆蟲中的免疫信號通路[16]和革蘭氏陽性細菌激活，并且 Imd 途徑被革蘭氏陰性細菌激活。這兩種信號傳導途的蛋白質轉移到細胞核中導致抗菌肽的誘導。Figure 1.1 Immune signaling pathways in insects. activated by fungi and Gram-positive bacteria, and Imd pathway is activated by Gram

圖 1.2 抗菌肽作用模式模型的示意圖[67]。子微生物表面的靜電吸引，（B）穿過外膜和/或肽聚糖層的通過，（C）對細胞質膜中陰）結構化，膜插入和積累，，（E）環(huán)形孔形成，（F）用于膜透化的地毯機制，（G）桶效應（DNA/蛋白質結合，膜組成重排，對基本細胞機器的干擾等）。 1.2 Schematic representation of the proposed models for the mode of action
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S881

【參考文獻】

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本文編號：2703794