【摘要】：家蠶既是重要的泌絲經(jīng)濟昆蟲,也是蠶桑產(chǎn)業(yè)和歷史文化的重要載體。而家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上最常見的、危害最嚴重的一類家蠶病原微生物。Bm NPV是完全的胞內(nèi)寄生生物,其自身基因組簡單,不具細胞結(jié)構(gòu),通常利用宿主的營養(yǎng)物質(zhì)和信號通路來完成自身的生命周期。病毒感染宿主細胞會引發(fā)宿主的一系列反應(yīng),如細胞凋亡、DNA損傷應(yīng)答、熱休克反應(yīng)和能量代謝等。其中,細胞凋亡作為機體重要的生物學過程,受內(nèi)外環(huán)境變化或凋亡信號觸發(fā),其是在基因調(diào)控下所發(fā)生的清除衰老、多余和受損細胞以維持自身穩(wěn)定的一種自我調(diào)節(jié)方式。細胞凋亡幾乎存在于所有的多細胞生物,在生物體生長發(fā)育、組織分化和細胞免疫維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程中扮演重要角色。病毒本身隨著宿主防御系統(tǒng)進化而協(xié)同進化,進而逃逸宿主細胞的抗病毒機制。昆蟲缺乏哺乳動物的獲得性免疫系統(tǒng),而細胞凋亡作為其重要的免疫應(yīng)答組成部分,這對研究病毒與宿主相互作用,及病毒如何利用宿主信號通路來實現(xiàn)自身增殖復(fù)制是一個很好的切入點。本研究對家蠶核型多角體病毒凋亡抑制因子Bm NPV iap2基因進行功能鑒定,探究Bm NPV IAP2及其相互作用蛋白在Bm NPV侵染過程中對宿主細胞凋亡調(diào)控的機制,初步解析Bm NPV iap2基因在Bm NPV增殖過程中的作用機制,為解析Bm NPV利用Bm NPV iap2基因調(diào)控宿主細胞凋亡利于自身增殖提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:1.Bm NPV iap2基因的功能鑒定通過序列分析發(fā)現(xiàn)Bm NPV iap2基因的ORF長750 bp,編碼249個氨基酸(aa),預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為28.72 k Da,等電點為9.51。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明Bm NPV IAP2從80 aa到153 aa為BIR結(jié)構(gòu)域,202 aa到236 aa為N端RING結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果顯示桿狀病毒IAP2主要以α-桿狀病毒為主,具有相對較高的保守性,此外,桿狀病毒的IAP2與昆蟲IAP關(guān)系較近(尤以鞘翅目、膜翅目為主),該結(jié)果與推測桿狀病毒IAP是通過昆蟲水平轉(zhuǎn)移相一致。成功構(gòu)建了BmNPV iap2基因的真核過表達載體和基于CRISPR/Cas9的敲除載體,Bm NPV iap2基因的過表達載體轉(zhuǎn)染家蠶Bm E-SWU1細胞,免疫熒光結(jié)果表明Bm NPV IAP2主要定位于細胞質(zhì),Western Blotting檢測到約30.71 k Da處存在特異性條帶;基于CRISPR/Cas9在Bm NPV中成功敲除Bm NPV iap2基因,通過Hoechst染色、TUNEL檢測、Caspase活性檢測分析和流式細胞術(shù)等技術(shù)檢測顯示,在Bm NPV侵染Bm E-SWU1細胞中,敲除Bm NPV iap2基因后細胞核染色質(zhì)固縮呈典型凋亡小體,與對照相比,敲除Bm NPV iap2基因凋亡小體比例達到20%。此外,與對照相比,TUNEL檢測綠色熒光明顯增強,Caspase-9和Caspase-3/7活性均顯著上升,凋亡細胞比例增加11%,表明Bm NPV iap2經(jīng)CRISPR/Cas9敲除后引發(fā)細胞凋亡;利用q RT-PCR技術(shù)和Western Blotting技術(shù),過表達Bm NPV iap2上調(diào)病毒基因ie1和vp39表達,促進Bm NPV增殖,敲除Bm NPV iap2下調(diào)病毒基因ie1和vp39表達,抑制Bm NPV增殖。2.BmNPV IAP2相互作用蛋白的鑒定為了鑒定Bm NPV IAP2的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以Bm NPV IAP2為誘餌,進行免疫共沉淀-質(zhì)譜分析,篩選到Bm NPV IAP2可能的相互作用蛋白Bm PP5和Bm HSP60,通過熒光共定位和免疫共沉淀等方法鑒定其與Bm NPV IAP2的確存在相互作用。Bm PP5從19 aa到120 aa為三個串聯(lián)TPR結(jié)構(gòu)域,195 aa到471 aa為PP2Ac結(jié)構(gòu)域,可能參與了線粒體細胞周期;HSP60從359 aa到395 aa為Coiled coil結(jié)構(gòu)域,556 aa到572 aa為Low complexity結(jié)構(gòu)域,主要參與蛋白質(zhì)到線粒體的正確靶向、蛋白質(zhì)“從頭”折疊和熱激反應(yīng)等。成功構(gòu)建了Bmpp5和Bm Hsp60基因的真核過表達載體及基于CRISPR/Cas9的敲除載體,通過Hoechst染色和Caspase活性檢測分析顯示,敲除Bm Hsp60、Bmpp5細胞核染色質(zhì)固縮,呈現(xiàn)典型的凋亡小體,與對照相比,敲除Bm Hsp60、Bmpp5凋亡小體比例分別達到12%和15%。此外,與對照相比,Caspase-9和Caspase-3/7活性均顯著上升,說明Bmpp5和Bm Hsp60基因經(jīng)CRISPR/Cas9敲除后引發(fā)細胞凋亡。此外,Bm HSP60在抗病毒方面的研究已經(jīng)報道,本文著重研究關(guān)于Bm PP5的抗病毒功能。通過q RT-PCR技術(shù)和Western Blotting技術(shù),過表達Bmpp5上調(diào)病毒基因ie1和vp39表達,促進Bm NPV增殖;敲除Bmpp5下調(diào)病毒基因ie1和vp39表達,抑制Bm NPV增殖。為進一步探索Bm NPV IAP2相互作用蛋白對Bm NPV IAP2的調(diào)控,Bm NPV侵染過程中,在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平利用q RT-PCR和Caspase活性檢測分析技術(shù)分析,結(jié)果表明,過表達Bmpp5上調(diào)表達Bm NPV iap2;敲除Bmpp5下調(diào)表達Bm NPV iap2。Caspase活性檢測分析表明,敲除Bmpp5影響B(tài)m NPV iap2抑制細胞凋亡功能。3.Bm NPV iap2、Bmiap和Bmpp5共同調(diào)控宿主細胞凋亡確定Bm NPV IAP2、Bm IAP和Bm PP5兩兩之間存在相互作用。利用q RTPCR分析Bm NPV侵染過程中Bmiap、Bmpp5與Bm NPV iap2基因的表達模式,結(jié)果表明Bm NPV侵染過程中,Bmiap表達下調(diào),Bmpp5與Bm NPV iap2上調(diào)表達。為了探究Bm NPV利用Bm NPV iap2調(diào)控宿主細胞凋亡機制,通過q RT-PCR和Western Blotting技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平研究Bm NPV iap2、Bmiap和Bmpp5共同調(diào)控宿主細胞凋亡和Bm NPV增殖復(fù)制,結(jié)果證明Bm NPV侵染過程中,Bm NPV iap2和Bmpp5上調(diào)表達Bmiap;過表達Bm NPV iap2和Bmpp5能增強Bmiap抗H_2O_2誘導(dǎo)的細胞凋亡。此外,過表達Bm NPV iap2和Bmpp5能增強Bmiap引起的促進病毒增殖作用。
【圖文】：

成異源復(fù)合體，進一步招募起始 Caspase-9 前體，Caspase-9 通過自我剪切進行活化，活化后的起始 Caspase 進一步激活下游執(zhí)行 Caspase，導(dǎo)致 Caspase 級聯(lián)放大，誘導(dǎo)宿主細胞發(fā)生凋亡[11-13]。而Caspase非依賴型線粒體通路由AIF和EndoG從線粒體釋放和核易位引起，造成核 DNA 片段化等[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路屬于內(nèi)源性細胞凋亡通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅是合成蛋白質(zhì)的工廠，也是 Ca2+的主要儲存庫。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在維持細胞蛋白的合成、加工及 Ca2+離子的穩(wěn)定中發(fā)揮舉足輕重的作用。當機體細胞受營養(yǎng)不良和缺氧等外界刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi) Ca2+離子紊亂，錯誤折疊蛋白增多，通常引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（endoplasmic reticulum stress, ERS），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可以減少細胞中蛋白質(zhì)的合成，增加蛋白正確的折疊并維持 Ca2+穩(wěn)態(tài)。但過度的應(yīng)激反應(yīng)會使得 Ca2+大量釋放到胞質(zhì)，激活和轉(zhuǎn)移依賴于 Ca2+的蛋白酶到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，進一步剪切活化起始 Caspase-12，活化的 Caspase-12 激活下游的執(zhí)行 Caspase-3/7，觸動細胞內(nèi)的凋亡信號，促使細胞凋亡[15, 16]。三種凋亡途徑在生物體中并非完全獨立，而是形成以線粒體通路為主導(dǎo)，其余各通路之間相互聯(lián)系，共同介導(dǎo)機體細胞凋亡。

圖 1.2 IAP 介導(dǎo) Caspase 參與細胞凋亡不同機制[75]a：IAPs 直接抑制 Caspase；b：泛素介導(dǎo)的 Caspase 調(diào)節(jié)。Fig 1.2 Different mechanisms of IAP-mediated Caspase involvement in apoptosis[75]a: IAPs directly inhibit Caspase; b: ubiquitin-mediated Caspase regulation..4 IAP 介導(dǎo)其他信號通路IAP 除了參與典型的細胞凋亡功能，在其他信號通路中也扮演重要角色受各種胞內(nèi)應(yīng)激（包括 DNA 損傷）激活轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 家族，根據(jù) NF-κ活機制不同，分為 NF-κB 經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路[76, 77]。這兩種通路都是素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，，包括泛素連接酶、泛素受體和去泛素化酶的聚集、識除泛素信號，允許受控蛋白質(zhì)復(fù)合物組裝，調(diào)節(jié) NF-κB 信號通路[78,79]。IA素連接酶活性的 RING 結(jié)構(gòu)域，已成為 NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵調(diào)控。昆蟲 徑與哺乳動物 TNF 介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)，因為二者在結(jié)構(gòu)上和功能上的成分[80]。黑腹果蠅 DIAP2 最早被證明調(diào)節(jié) NF-κB 信號通路，DIAP2 K1-TAB2 或 TAB3 介導(dǎo)的激活 NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子非常必要[81-83]。缺乏 DIAP
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S884.51;Q933

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 彭黎明,江虹;細胞凋亡檢測方法的研究進展[J];中華病理學雜志;2001年02期

本文編號：2702710