【摘要】：類病毒是不編碼任何蛋白的單鏈環(huán)狀小RNA分子,通過機(jī)械方式侵染植物細(xì)胞,在某些重要的經(jīng)濟(jì)作物上可導(dǎo)致嚴(yán)重的病害。目前為止,已經(jīng)證明柑橘植物至少是8種類病毒的天然寄主,分別為柑橘裂皮類病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘曲葉類病毒(Citrus bent leaf viroid,CBLVd)、啤酒花矮化類病毒(Hop stunt viroid,HSVd)、柑橘矮化類病毒(Citrus dwarfing viroid,CDVd)、柑橘樹皮裂紋類病毒(Citrus bark cracking viroid,CBCVd)、柑橘類病毒V(Citrus viroid V,CVd-V)、柑橘類病毒VI(Citrus viroid VI,CVd-VI)和柑橘類病毒VII(Citrus viroid VII,CVd-VII)。其中,CEVd的特定株系可在被廣泛用作砧木的枳殼(Poncirus trifoliata)和枳橙(Citrus sinensis×P.trifoliate)上引起明顯的裂皮癥狀,并可通過嫁接等機(jī)械方式在商業(yè)果園中快速傳播,對(duì)我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展可造成一定為害。CBCVd被認(rèn)為是CEVd和HSVd的嵌合重組體,可侵染大量的柑橘種類和柑橘近屬而沒有明顯的癥狀。前人通過田間癥狀觀察證實(shí)CBCVd在枳殼砧木上對(duì)CEVd存在拮抗現(xiàn)象,兩種類病毒復(fù)合侵染會(huì)降低CEVd在敏感砧木上的癥狀,但是其分子機(jī)理尚不詳。“Etrog”香櫞(C.medica)中的“Arizona 861-S1”品系被廣泛用作柑橘類病毒的指示植物,為研究柑橘類病毒間的互作機(jī)制提供了一個(gè)有利平臺(tái)。目前類病毒與宿主的互作研究多集中于草本寄主,而類病毒的自然侵染報(bào)道多見于木本植物如柑橘等,木本植物與類病毒的互作研究更具生產(chǎn)實(shí)踐價(jià)值。本研究進(jìn)行了柑橘類病毒的鑒定和侵染性克隆的構(gòu)建,分析了柑橘裂皮病潛在拮抗資源CBCVd的遺傳多樣性,之后借助下一代測(cè)序技術(shù)(NGS)分析了CEVd單獨(dú)侵染及其與CBCVd復(fù)合侵染時(shí)寄主香櫞的反饋調(diào)節(jié),對(duì)CEVd和CBCVd間存在的交叉保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了分析。一、遺傳多樣性分析(1)CEVd和CBCVd毒源的鑒定及遺傳多樣性分析為明確不同地域間柑橘類病毒分離株的差異,選取CEVd和CBCVd分離株構(gòu)建侵染性克隆,本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的類病毒資源進(jìn)行了鑒定與遺傳多樣性分析。通過對(duì)來自巴基斯坦的柑橘樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,獲得了CEVd、CBLVd、HSVd、CBCVd、CDVd和CVd-V的全基因組序列。從巴基斯坦柑橘樣品中獲得的CEVd、CBLVd、HSVd、CDVd和CVd-V序列與已報(bào)道的序列差異較小,巴基斯坦CEVd序列(Contig-4665)與從中國(guó)柑橘品種“眉山9號(hào)”分離得到的中國(guó)CEVd分離株主序列完全相同。新發(fā)現(xiàn)的巴基斯坦CBCVd序列與CBCVd RefSeq序列(NC_003539)具有較低的序列相似性(80.9%~88.9%),暫命名為“CBCVd-LSS”。對(duì)巴基斯坦和中國(guó)CBCVd序列的分子特征分析發(fā)現(xiàn),來自中國(guó)的CBCVd序列長(zhǎng)度為282~286nt,而來自巴基斯坦的CBCVd序列長(zhǎng)度為273~277nt。巴基斯坦CBCVd序列與來自中國(guó)和其它國(guó)家的CBCVd序列在基因組和二級(jí)結(jié)構(gòu)上差異顯著,分析認(rèn)為巴基斯坦可能是CBCVd的獨(dú)立地理起源之一。因與參照序列具有較高序列同源性,來自“眉山9號(hào)”的CEVd分離株和來自“朱見”的CBCVd分離株被篩選出來用以進(jìn)行侵染性克隆構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。(2)CEVd和CBCVd侵染性克隆的構(gòu)建與子代種群遺傳多樣性分析本研究報(bào)道了一種通過一步法RT-PCR快速制備CEVd的cDNA二聚體的方法,并驗(yàn)證了獲得的二聚體cDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以成功侵染寄主植物。另外,這種快速制備cDNA二聚體的方法也適用于CBCVd。本研究制備類病毒二聚體cDNA的方法與傳統(tǒng)方法相比精簡(jiǎn)了步驟,獲得的類病毒RNA可以在植物組織中完成系統(tǒng)侵染,表明應(yīng)用這種方法制備CEVd(CBCVd)二聚體cDNA是可行的。本研究對(duì)CEVd和CBCVd侵染香櫞后的子代種群的分析表明,CBCVd子代種群有更復(fù)雜的種群結(jié)構(gòu)和更高的變異水平,單倍型多樣性和核苷酸多樣性也更為豐富。兩者子代種群均具有復(fù)雜的變種序列,尤其是在CBCVd子代種群序列中發(fā)現(xiàn)了一條出現(xiàn)頻率接近原始接種序列但不同的優(yōu)勢(shì)序列。以上結(jié)果表明在用單一柑橘類病毒序列接種香櫞后,柑橘類病毒迫于宿主選擇壓力會(huì)形成復(fù)雜的種群結(jié)構(gòu)以適應(yīng)寄主環(huán)境,從而產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳多樣性。二、拮抗機(jī)制分析(1)香櫞對(duì)CEVd侵染的響應(yīng)機(jī)制分析本研究利用CEVd侵染的香櫞來研究木本寄主對(duì)CEVd侵染在轉(zhuǎn)錄組和小RNA(sRNA)水平上的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,并對(duì)深度測(cè)序結(jié)果的可靠性進(jìn)行了定量PCR驗(yàn)證。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示CEVd侵染引起香櫞葉片廣泛的變化,激活基因沉默通路、觸發(fā)基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)、破壞植物激素穩(wěn)態(tài)等。CEVd在寄主香櫞中的復(fù)制誘導(dǎo)典型的抗類病毒防御反應(yīng)RNA沉默途徑中編碼關(guān)鍵蛋白DCL2(Dicer-like 2)、RDR1(RNA-dependent RNA polymerase 1)、AGO2(Argonaute 2)、AGO7的基因顯著上調(diào)表達(dá)。在CEVd侵染的香櫞植物中與基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)的基因也被顯著誘導(dǎo),編碼核苷酸門控離子通道(CNGCs)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、鈣結(jié)合蛋白(CMLs)、富亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶(FLS2)和呼吸爆發(fā)氧化酶(Rboh)的基因顯著上調(diào),編碼抗病蛋白、致病相關(guān)蛋白以及熱激蛋白70(HSP70)的基因也得到積累以響應(yīng)CEVd侵染。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在CEVd侵染香櫞中發(fā)生改變,CEVd侵染的香櫞植株有明顯矮化現(xiàn)象,可能與CEVd侵染后生長(zhǎng)素(IAA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制有關(guān)。CEVd侵染激活茉莉酸(JA)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,赤霉素(GA)和油菜素內(nèi)酯(BR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也被CEVd侵染誘導(dǎo)。sRNA深度測(cè)序數(shù)據(jù)顯示CEVd侵染引起香櫞sRNA水平的廣泛變化。CEVd侵染可以在整體上影響香櫞宿主非編碼RNA(ncRNA)的表達(dá),以及誘導(dǎo)21-nt、22-nt的sRNA的生成,相對(duì)抑制24-nt sRNA的產(chǎn)生。本研究共鑒定到116種差異表達(dá)的微小RNA(DEmiRNA)響應(yīng)CEVd的侵染,一些DEmiRNA靶基因與RNA沉默反應(yīng)、植物基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物脅迫反應(yīng)相關(guān),sRNA或許可通過調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)參與類病毒與寄主的互作反應(yīng),廣泛參與寄主香櫞對(duì)CEVd的反饋調(diào)節(jié)。以上結(jié)果表明,RNA沉默機(jī)制和香櫞植物基礎(chǔ)防衛(wèi)機(jī)制共同應(yīng)對(duì)CEVd侵染,有助于我們深入理解CEVd的致病機(jī)制。(2)CBCVd對(duì)CEVd拮抗作用分子機(jī)理的分析CEVd和CBCVd基因組序列在右手末端區(qū)有80~90-nt高度同源,兩者復(fù)合侵染可減弱枳殼砧木的裂皮癥狀。本研究在二者復(fù)合侵染的香櫞中發(fā)現(xiàn),CEVd前期侵染過程中在分子水平上CBCVd對(duì)CEVd有顯著的拮抗表現(xiàn),癥狀表現(xiàn)上也有一定的拮抗表現(xiàn)。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)分析,在不同柑橘類病毒侵染的香櫞中觀察到宿主植物相似的響應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制。sRNA深度測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)CEVd和CBCVd侵染均能誘導(dǎo)香櫞21~22-nt sRNA的積累。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示來源于CEVd和CBCVd的sRNA大小均以21-nt和22-nt為主且CEVd和CBCVd來源的sRNA在同源區(qū)域顯著富集。CEVd和CBCVd正負(fù)鏈來源的21-nt和22-nt大小的sRNA的5’堿基偏好性均以U和C為主,僅是U和C占比不同,復(fù)合侵染時(shí)對(duì)基因沉默通路AGO蛋白應(yīng)存在一定的競(jìng)爭(zhēng)。CEVd和CBCVd來源sRNA中22-nt大小的sRNA最為豐富,主要由DCL2產(chǎn)生的22-nt sRNA以及RDR1與沉默擴(kuò)增相關(guān),分析認(rèn)為DCL2和RDR1可能在類病毒與香櫞的互作中處于重要位置。以上結(jié)果表明RNA沉默機(jī)制參與柑橘類病毒與其宿主的互作,香櫞上CBCVd對(duì)CEVd存在拮抗表現(xiàn),拮抗機(jī)制應(yīng)與兩者同源區(qū)域產(chǎn)生的大量相同類型的sRNA和RNA沉默通路有關(guān)。CEVd和CBCVd在兩者同源區(qū)域產(chǎn)生大量相同類型的sRNA,以及這些sRNA在基因沉默通路中扮演的重要角色,或許可以幫助我們理解二者在香櫞寄主上引起相似癥狀及存在拮抗作用可能的分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S436.66

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 夏民旋;王維;袁瑞;鄧粉妮;沈法富;;超氧化物歧化酶與植物抗逆性[J];分子植物育種;2015年11期

2 齊妍;徐兆師;李盼松;陳明;李連城;馬有志;;植物熱激蛋白70的分子作用機(jī)理及其利用研究進(jìn)展[J];植物遺傳資源學(xué)報(bào);2013年03期

，

本文編號(hào)：2698853