【摘要】：細胞自噬(autophagy)是真核生物對胞內(nèi)物質(zhì)進行自身降解的重要生物學(xué)過程,此過程中損壞的蛋白或不需要的細胞器被雙層膜的自噬小泡包裹后送入溶酶體(動物)或液泡(植物和酵母)中進行降解并循環(huán)利用。細胞自噬參與多種生理生化反應(yīng),包括神經(jīng)退行性疾病、癌癥、饑餓、細菌或病毒感染等,其中病毒感染與自噬關(guān)系的研究對于更好的理解宿主與病毒互作機制具有重要的生物學(xué)意義。家蠶,作為重要的經(jīng)濟昆蟲,由于被長期馴化飼養(yǎng)逃避了自然環(huán)境的選擇,是研究病毒感染與宿主互作的良好素材。家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)屬于桿狀病毒屬,是一類具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒。病毒感染宿主的過程中調(diào)控宿主多種機制以利于自身增殖復(fù)制,同時伴隨著各種宿主應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。近年來,隨著對BmNPV感染機制研究的深入,部分宿主抗性機制得到解析,但是病毒與宿主的互作網(wǎng)絡(luò)仍然不清楚。本研究利用家蠶與BmNPV這一模型,發(fā)現(xiàn)了BmNPV感染能影響家蠶細胞自噬;隨后,在細胞和個體水平分別利用過表達和CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù),證實了自噬相關(guān)基因?qū)Σ《靖腥竞蛷?fù)制增殖的影響;最后,通過免疫共沉淀和質(zhì)譜分析探究了自噬相關(guān)基因影響病毒感染的分子機制。通過本研究,可為揭示家蠶細胞自噬與BmNPV感染的互作機制提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。論文取得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:1.BmNPV感染對家蠶細胞自噬的影響本研究通過多種經(jīng)典的自噬檢測方法證實了BmNPV感染可以誘導(dǎo)家蠶卵巢細胞系BmN-SWU1細胞發(fā)生自噬。首先通過透射電子顯微鏡觀察到BmNPV感染的細胞中出現(xiàn)大量的雙層膜自噬小泡,與饑餓誘導(dǎo)的陽性對照相似,而正常培養(yǎng)的細胞中則幾乎不存在這種囊泡結(jié)構(gòu)。通過免疫熒光觀察ATG8-GFP(自噬體膜標(biāo)記蛋白)綠色熒光聚點的情況,發(fā)現(xiàn)病毒感染細胞的早期(6h),細胞中ATG8-GFP綠色熒光聚點明顯增加,而在感染晚期又逐漸減少;統(tǒng)計結(jié)果表明感染早期含有綠色熒光聚點的細胞百分比以及單個細胞中熒光聚點的數(shù)目都有明顯增加的趨勢。免疫印跡檢測ATG8向ATG8-PE(具有膜結(jié)合能力的ATG8蛋白)的轉(zhuǎn)化在病毒感染早期顯著加強;ATG8-PE/Tubulin的灰度計算和倍率分析也顯示同樣的結(jié)果。自噬體的出現(xiàn)并不能表明其最終會與溶酶體融合發(fā)生降解而形成完整的自噬流,因此我們進一步檢測了自噬流的發(fā)生情況。我們構(gòu)建了ATG8-GFP-RFP雙熒光檢測系統(tǒng),共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)病毒感染后的細胞中存在大量只發(fā)紅光而不發(fā)綠光的熒光聚點(即自噬溶酶體),而對照中紅色熒光則與綠色熒光完全散在重合。p62蛋白作為目前研究最清楚的選擇性自噬受體,其降解也是自噬流發(fā)生的典型標(biāo)志。通過p62蛋白的檢測和分析,結(jié)果顯示在病毒感染早期p62發(fā)生顯著的降解現(xiàn)象。以上結(jié)果表明BmNPV感染確實會誘導(dǎo)家蠶BmN-SWU1細胞發(fā)生完整的自噬。2.自噬相關(guān)基因?qū)mNPV感染家蠶細胞的影響自噬相關(guān)基因(Autophagy-related genes,Atgs)是一類保守的在自噬通路中起關(guān)鍵作用的基因。通過保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測和分析,我們發(fā)現(xiàn)家蠶中目前鑒定的15個Atgs(Atg1-9、Atg11-14、Atg16和Atg18)基因均具有其保守的自噬基因相關(guān)結(jié)構(gòu)域。通過實時熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)所有的自噬相關(guān)基因的表達在病毒感染的過程中都出現(xiàn)了明顯的波動,其中大部分呈現(xiàn)早期上調(diào)而后下降的趨勢,與病毒誘導(dǎo)自噬發(fā)生的趨勢一致。隨后通過過表達單個Atg基因檢測下游Atg8和Atg12基因的表達情況,發(fā)現(xiàn)過表達單個Atg基因可引起下游Atg8和Atg12基因表達量的增加。實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)過表達單個Atg基因時病毒ie-1基因(病毒立即早期基因)表達顯著上調(diào),而敲除單個Atg基因時病毒ie-1基因則顯著下調(diào);進一步篩選部分Atgs基因的過表達和敲除樣品,檢測發(fā)現(xiàn)vp39(病毒晚期基因)和p10(病毒極晚期基因)的表達水平也出現(xiàn)了過表達上調(diào)而敲除下調(diào)的趨勢。以上結(jié)果證明單個自噬相關(guān)基因的變化即可影響病毒關(guān)鍵基因的表達。通過篩選自噬通路上不同階段行使功能的自噬相關(guān)基因,結(jié)合前期結(jié)果中對病毒感染影響的顯著性以及對自噬本身的影響效果,我們最終選擇Atg7、Atg9和Atg13作為后續(xù)研究的關(guān)鍵基因。3.自噬相關(guān)基因?qū)mNPV感染家蠶個體的影響為了確定自噬相關(guān)基因?qū)Σ《靖腥舅拗鱾�體的影響,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因家蠶并對其感染病毒的情況進行分析。首先,我們構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體。通過轉(zhuǎn)基因注射和篩選成功獲得三個轉(zhuǎn)基因過表達品系,命名為BmAtg7-OE,BmAtg9-OE和BmAtg13-OE,定量檢測表明轉(zhuǎn)基因品系均可顯著高量表達靶標(biāo)基因。另外還獲得了sgAtg13-DsRed品系,通過與本實驗室先前保存的Cas9-EGFP品系雜交,篩選獲得了雙光的敲除品系,命名為BmAtg13-KO,提取基因組T克隆測序表明敲除效率高達70%。四齡起大造和轉(zhuǎn)基因品系同時添食10~6病毒粒子,通過致死率統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因過表達家蠶品系具有顯著的較高致死率,而BmAtg13-KO敲除品系則表現(xiàn)出一定的抗性。病毒基因組拷貝數(shù)分析和病毒關(guān)鍵基因的表達也呈現(xiàn)出與感染后致死率統(tǒng)計一致的結(jié)果。以上結(jié)果充分說明自噬相關(guān)基因?qū)Σ《靖腥緜�體的過程具有顯著的影響。4.BmAtg13影響B(tài)mNPV感染宿主效率的機制研究為了探究自噬相關(guān)基因影響病毒感染的分子機制,根據(jù)前期研究數(shù)據(jù)我們將Atg13基因(自噬起始復(fù)合物ULK1的重要成員之一)作為進一步機制研究的靶基因。首先我們通過序列比對,保守結(jié)構(gòu)域分子模型預(yù)測以及進化樹分析確認了Atg13基因的保守性。然后利用免疫共沉淀和質(zhì)譜分析釣取到ATG13互作候選蛋白,包括家蠶蛋白polyubiquitin、ATG7、Hsp70以及大量核糖體蛋白和病毒蛋白Orf5、Orf10與Bro-B。免疫熒光共定位和免疫共沉淀的驗證,確認了ATG13與Bro-B,ATG13與ATG7的互作關(guān)系。Bro-B是桿狀病毒延遲早期蛋白,具有核酸結(jié)合活性,可以影響宿主蛋白的合成而有利于自身的感染。ATG13與Bro-B的互作可能涉及宿主與病毒的相互調(diào)控。ATG7是自噬兩個類泛素共軛系統(tǒng)的關(guān)鍵修飾酶,對自噬體的成膜和延伸至關(guān)重要。ATG13與ATG7的互作可能與ATG13作為自噬上游起始復(fù)合物一員調(diào)控自噬發(fā)生的功能有關(guān)。截短分析Bro-B與ATG13的互作結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)ATG13的N端HORMA結(jié)構(gòu)域僅與Bro-B的N端可以發(fā)生共定位,而ATG13的C端無結(jié)構(gòu)域序列則與Bro-B的N和C端均可發(fā)生共定位。最后通過檢測兩者的相互調(diào)控關(guān)系發(fā)現(xiàn)BmAtg13處于Bro-B的上游,BmAtg13過表達抑制Bro-B的表達,而敲除則促進Bro-B的表達。上述研究證實了BmAtg13與病毒之間存在的博弈,為深入研究自噬與病毒互作機制提供了理論參考和方向。
【圖文】：

圖 1.1 細胞自噬的發(fā)生[15]細胞發(fā)生自噬時，自噬體的形成主要經(jīng)歷以下過程：起始、延伸、關(guān)閉、成Fig. 1.1 The occurrence of autophagy[15]l stimulus induces autophagy, the formation of autophagic is mainly through theion, closure, murturation and degradation.關(guān)基因的功能和調(diào)控機制研究65 年，科學(xué)家就通過電子顯微鏡觀察到了哺乳動物細胞

圖 1.2 自噬通路的分子機制[19]續(xù)抑制自噬的誘導(dǎo)中起著核心作用；b，吞噬泡的形成是由 III 型 PI3K 復(fù)合物介導(dǎo)的合涉及兩個類泛素共軛系統(tǒng)；d，在各種正向和負向調(diào)控因子的調(diào)節(jié)下，完整的自噬熟的自噬溶酶體。Fig 1.2 The molecular mechanism of autophagy pathway[19]. a central role in constitutively suppressing induction of autophagy; b,Formation of the pha class III PI3K complex; c, Growth and closure of the autophagosome membrane; d, The fuses with lysosome and matures into autolysosome.，Lin 等總結(jié)介紹了哺乳動物中在自噬發(fā)生和調(diào)控方面具有重要 1）。其中涵蓋了自噬體形成所需關(guān)鍵基因的功能分析[21-37]，即噬相關(guān)基因，還包括了自噬調(diào)控的關(guān)鍵基因以及其調(diào)控機制的總 和 Beclin-1 兩大蛋白的調(diào)控）[38-40]，具有重要的參考價值。m絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，，是整合生長因子、營養(yǎng)、能量狀態(tài)以
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S884.51

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本文編號：2695316