【摘要】：水稻Oryza sativa是全世界人民重要的谷類糧食作物之一,水稻豐產(chǎn)豐收和人民的生活息息相關(guān)。稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis,又名苞葉蟲等,屬于鱗翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae,是稻米中最具有破壞力的害蟲之一。幾丁質(zhì)(chitin)又名甲殼素,是重要器官的主要成分,例如昆蟲表皮和中腸,并且是昆蟲生長和發(fā)育所必需的。昆蟲海藻糖酶(Tre)和甲殼素合成酶(CHS)分別是昆蟲合成甲殼素過程中的第一種和最后一種酶,它們在昆蟲甲殼素的合成中起重要作用,并且是治理害蟲的理想目標。隨著RNA干擾技術(shù)的闡明,近年來,該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應用于昆蟲基因功能和害蟲防治的研究。本研究以稻縱卷葉螟C.medinalis為研究對象,以海藻糖酶和甲殼素合成酶基因為靶標,體外合成雙鏈RNA(dsRNA),通過注射RNAi技術(shù)檢測dsRNA對稻縱卷葉螟靶標基因的抑制效率,再利用轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù),在水稻中表達海藻糖酶和甲殼素合成酶基因的dsRNA,稻縱卷葉螟在取食這種轉(zhuǎn)基因水稻后引起RNAi效應,導致其生長發(fā)育受阻,蛻皮困難導致死亡,從而實現(xiàn)稻縱卷葉螟的綠色防控。1.注射dsRNA沉默CmTre和CmCHS的表達根據(jù)本實驗室克隆的稻縱卷葉螟海藻糖酶基因(CmTre)和幾丁質(zhì)合成酶基因(CmCHS)的開放閱讀框(ORF)設(shè)計靶標位點,并在體外合成各自的dsRNA(dsCmTre,dsCmCHS),用水稻葉片的第三齡幼蟲注射dsRNA,觀察試蟲表型變化和幼蟲生長情況,計算各組死亡率,并通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測試蟲體內(nèi)CmTre和CmCHS的表達量。結(jié)果顯示,注射dsCmTre和dsCmCHS處理組幼蟲取食量減少,活性降低,體型變小,體重減輕,并出現(xiàn)典型的致死表型,部分出現(xiàn)死亡情況,而注射dsGFP對照組蟲體表型無明顯變化,生長發(fā)育情況良好。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,在注射dsRNA 5 d后,相比于注射dsGFP的對照組,dsCmTre和dsCmCHS處理組CmTre1的表達下降了48.54%、CmTre2的表達下降了51.03%、CmCHSA的表達下降了59.07%、CmCHSB的表達下降了58.80%。以上結(jié)果表明,注射dsCmTre和dsCmCHS后稻縱卷葉螟幼蟲生長發(fā)育受阻,蛻皮困難,CmTre和CmCHS的表達量顯著被抑制,具有明顯致死效應。2.RNAi表達載體的構(gòu)建與鑒定以注射RNAi驗證的靶標序列為目的片段,將其正向序列和反向互補序列各自插入到水稻磷脂酶D基因(PLD)部分內(nèi)含子的兩側(cè),經(jīng)公司合成并克隆到載體PUC57后,再經(jīng)過酶切連接到表達載體pCAMBIA1301上,構(gòu)建重組植物RNAi p1301-Tre-CHS的表達載體,通過PCR,酶切和雙重測序后將重組RNAi表達載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中,成功制備了基因工程菌。3.轉(zhuǎn)基因植物的遺傳轉(zhuǎn)化及RNAi檢測用含RNAi表達載體的農(nóng)桿菌侵染蜀恢527水稻愈傷組織,經(jīng)過共培養(yǎng),抗性篩選,分化,生根,獲得10株轉(zhuǎn)基因水稻。用轉(zhuǎn)基因水稻飼喂稻縱卷葉螟幼蟲,觀察其表型變化,死亡率變化,以及RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)基因水稻能否介導昆蟲體內(nèi)RNAi效應。結(jié)果顯示,試蟲在攝取轉(zhuǎn)基因水稻后,體型小與對照組,且出現(xiàn)明顯的致死表型,部分不能正�；�,或能生長至蛹,但蛹畸形或小于正常蛹。取食轉(zhuǎn)基因水稻5 d后,實驗組試蟲死亡率為46.67%,校正死亡率為45.45%,相比于對照組,死亡率增加了44.45%。RT-qPCR結(jié)果顯示,與對照組相比,用轉(zhuǎn)基因食物喂養(yǎng)的測試昆蟲中的CmTre1表達降低48.06%、CmTre2的表達下降了49.84%、CmCHSA的表達下降了54.22%、CmCHSB的表達下降了54.63%。以上結(jié)果表明,表達CmTre和CmCHS dsRNA的水稻能有效介導昆蟲體內(nèi)RNAi效應,對稻縱卷葉螟具有很好的防治效果。
【圖文】：

圖 2.1 dsRNA 合成電泳圖Fig. 2.1 Electrophoresis of dsRNAsynthesisA：CmTre、CmCHS 和 GFP 靶標序列擴增片段電泳圖；B：dsCmTre、dsCmCHS 和 dsGFP電泳圖。Note: A: Electrophoretogram of PCR amplication of CmTre, CmCHS and GFP; B:Electrophoretogram of dsCmTre, dsCmCHS and dsGFP. M: DL2000 DNAmarker.A B

貴州大學 2019 屆碩士論文圖 2.2 卷葉蟲可溶性海藻糖酶基因（A）、膜結(jié)合型海藻糖酶基因（B）、幾丁質(zhì)合成酶 A基因（C）和幾丁質(zhì)合成酶 B 基因（D）RT-qPCR 擴增產(chǎn)物的引物溶解曲線圖Fig 2.2 The dissociation curve of amplification product of CmTre1(A), CmTre2(B), CmCHSA(C)and CmCHSB(D) gene in RT-qPCR of C. medinalis
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.112.1

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本文編號：2693816