【摘要】：家蠶(Bombyx mori)是重要的泌絲經(jīng)濟昆蟲。絲腺是家蠶幼蟲特有的泌絲器官,絲蛋白大量合成的前提是絲腺細胞進行核內(nèi)周期(endocycle)。核內(nèi)周期,也稱為核內(nèi)復(fù)制周期,是正常有絲分裂細胞周期的變異形式,即細胞只進行DNA復(fù)制而不發(fā)生胞質(zhì)分裂,從而形成了多倍體細胞。家蠶絲腺細胞僅在胚胎期發(fā)生約10次有絲分裂,形成了包含前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺約1080個細胞。自此之后,絲腺細胞進入核內(nèi)周期,只進行DNA的合成和細胞體積的增大。在幼蟲期,絲腺細胞經(jīng)歷持續(xù)的17~19輪核內(nèi)周期,使得DNA含量達到正常二倍體細胞的約40萬倍,這為吐絲期絲蛋白的大規(guī)模合成奠定了遺傳基礎(chǔ)。果蠅和小鼠中核內(nèi)周期的研究表明,核內(nèi)周期的運轉(zhuǎn)是由細胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)活性的周期性振蕩驅(qū)動的。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKIs)是CDK的主要負調(diào)節(jié)因子,它能與細胞周期蛋白(cyclin)和CDK結(jié)合并抑制CDK的激酶活性。與自然界其它進行核內(nèi)周期的細胞相比,家蠶絲腺細胞發(fā)生核內(nèi)復(fù)制的時間跨度更長,DNA復(fù)制效率更高效,是研究核內(nèi)周期的理想材料,闡明絲腺細胞核內(nèi)周期的調(diào)控機制,可為完善家蠶細胞周期調(diào)控機制提供重要線索,也可為絲腺遺傳改良提供重要的理論依據(jù)。本研究對家蠶CKI進行了克隆和鑒定,并分析了該基因參與調(diào)控絲腺核內(nèi)周期的作用機制,為家蠶絲腺細胞核內(nèi)周期機制的解析和家蠶絲腺遺傳改良提供了有利依據(jù)。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:1.BmCKI基因的鑒定及特征分析家蠶基因組中僅存在一個Cip/Kip家族同源基因,將該基因命名為BmCKI。BmCKI有兩個剪切體,分別命名為BmCKI-L和BmCKI-S。這兩個剪切體具有不同的5’非編碼區(qū)(5’untranslated region,5’UTR),BmCKI-S從第二個外顯子處的起始密碼子進行翻譯。BmCKI-L的編碼區(qū)(coding sequence,CDS)全長654 bp,編碼217個氨基酸(amino acid,aa),而BmCKI-S的CDS長度為579 bp,編碼192個氨基酸,兩者的CDS僅在5’端相差75 bp。序列分析顯示,BmCKI-L和BmCKI-S存在Cip/Kip家族保守的結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域包含cyclin結(jié)合位點和CDK結(jié)合位點。系統(tǒng)發(fā)生樹分析顯示,家蠶BmCKI蛋白與果蠅的同源蛋白聚在一支,兩者同源性最高。免疫熒光分析BmCKI-L和BmCKI-S的亞細胞定位,結(jié)果顯示兩者均定位于細胞核。為了鑒定BmCKI的核定位信號,我們構(gòu)建了一系列BmCKI-L的截短突變,并通過免疫熒光分析其定位情況。結(jié)果表明,181-210 aa區(qū)域是BmCKI-L核定位序列所在之處,該區(qū)域存在一個非典型的二元核定位信號,該核定位信號前后由兩簇基本氨基酸組成,中間由16 aa連接,連接區(qū)域富含弱堿性的組氨酸。用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析了BmCKI-L和BmCKI-S的組織表達模式,發(fā)現(xiàn)BmCKI-L在表皮和卵巢的表達量較高,而在精巢的表達量較低;BmCKI-S在中腸的表達量比較高,而在絲腺的表達量最低,表明BmCKI-L和BmCKI-S存在不同的表達模式。2.BmCKI對家蠶細胞周期的調(diào)控為了在細胞水平上鑒定BmCKI的功能,我們首先在BmN-SWU1細胞系中,分別進行了過表達BmCKI-L和BmCKI-S的實驗研究。過表達BmCKI-L和BmCKI-S的實驗組中,G1期細胞顯著增加,S期和G2期細胞顯著減少,表明過表達BmCKI-L和BmCKI-S導(dǎo)致細胞周期阻滯在G1期;在過表達BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1細胞中BrdU標記率明顯下降,表明過表達BmCKI-L和BmCKI-S抑制DNA復(fù)制;過表達BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1細胞增殖活性顯著下降,表明過表達BmCKI-L和BmCKI-S抑制細胞增殖。同時,在BmN-SWU1細胞系中,分別進行了干涉BmCKI-L和BmCKI-S的實驗研究。干涉BmCKI-L和BmCKI-S的實驗組中,G2/M期細胞顯著增加,S期和G1期細胞顯著減少,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S使細胞積累于G2/M期;在干涉BmCKI-L和BmCKI-S的細胞中BrdU標記率顯著上升,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促進DNA復(fù)制;干涉BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1細胞增殖活性顯著上升,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促進細胞增殖。綜上表明,BmCKI-L和BmCKI-S參與細胞周期調(diào)控。為了探究BmCKI調(diào)控細胞周期的機制,我們利用qRT-PCR分別檢測了過表達和干涉BmCKI后各周期調(diào)控因子的相對表達量。結(jié)果顯示,過表達BmCKI-L和BmCKI-S后,周期蛋白cyclin A、cyclin B、cyclin D和cyclin E以及周期蛋白依賴性激酶CDK2和CDK4表達量顯著下調(diào),說明過表達BmCKI-L和BmCKI-S抑制G1和S期各周期調(diào)控因子的表達;干涉BmCKI-L和BmCKI-S后,周期蛋白cyclin A和cyclin B以及周期蛋白依賴性激酶CDK1表達量顯著上調(diào),說明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促進G2和M期周期調(diào)控因子的表達。3.BmCKI對家蠶個體生長發(fā)育的調(diào)控為了在個體水平上鑒定BmCKI的功能,我們利用家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù),創(chuàng)制了全蠶過表達BmCKI-L的轉(zhuǎn)基因品系,命名為BmCKI-L-OE。對BmCKI-L-OE品系G1代的蠶卵進行觀察,發(fā)現(xiàn)約2/3的胚胎致死,1/3的胚胎能成功孵化。相較于同齡期正常大造,BmCKI-L-OE幼蟲體型小且存在不同程度的發(fā)育遲緩,此外在飼養(yǎng)過程中BmCKI-L-OE幼蟲逐漸死亡。我們對BmCKI-L-OE品系在胚胎期和幼蟲期的存活率進行統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示在家蠶中過表達BmCKI-L會引起胚胎及幼蟲致死。解剖BmCKI-L-OE品系5齡幼蟲,發(fā)現(xiàn)BmCKI-L-OE品系幼蟲多個組織的發(fā)育存在異常,比如:馬氏管萎縮;氣管分支顯著減少且長度嚴重縮短;絲腺顯著變小;脂肪體很少。以上結(jié)果表明,BmCKI參與家蠶生長發(fā)育的調(diào)控。4.BmCKI對家蠶絲腺核內(nèi)周期的調(diào)控為了鑒定BmCKI是否參與絲腺細胞核內(nèi)周期調(diào)控,我們利用家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù),創(chuàng)制了絲腺組織特異性過表達BmCKI-L的轉(zhuǎn)基因品系,命名為Ser1~P-BmCKI-L-OE。表型分析結(jié)果顯示Ser1~P-BmCKI-L-OE幼蟲相比于正常大造體型明顯要小,體重明顯要輕;以及其絲腺的大小、長度、直徑和重量都要明顯小于大造幼蟲的,表明在家蠶絲腺組織中過表達BmCKI-L會抑制絲腺的生長發(fā)育。經(jīng)濟性狀分析結(jié)果顯示,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的全繭量、蛹重、繭層量相比于正常大造都顯著減輕;同時,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的繭層率相比于正常大造顯著減小。利用冷凍切片和DAPI染色檢測絲腺細胞DNA含量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ser1~P-BmCKI-L-OE品系前部、中部和后部絲腺的DAPI標記量均顯著低于大造組,說明Ser1~P-BmCKI-L-OE品系DNA含量比大造組少;對Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的絲腺體外進行BrdU標記以測定絲腺DNA復(fù)制情況,結(jié)果顯示,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系前部、中部和后部絲腺BrdU標記率均低于大造組,說明Ser1~P-BmCKI-L-OE品系絲腺DNA復(fù)制相較于大造品系減弱。以上結(jié)果表明,在絲腺組織中特異性過表達BmCKI-L抑制絲腺細胞的核內(nèi)周期。5.BmCKI相互作用蛋白的鑒定及作用機制研究為了鑒定BmCKI的作用機制,我們首先通過酵母雙雜交技術(shù),以BmCKI-L蛋白為誘餌篩選到3個與BmCKI-L可能存在相互作用的蛋白,分別是BmPCNA、BmRACK1和BmSTMN。通過酵母雙雜交回轉(zhuǎn)實驗,免疫熒光共定位以及免疫共沉淀技術(shù)證實這3個蛋白與BmCKI-L都具有相互作用。PCNA是DNA聚合酶的輔助因子,在DNA復(fù)制和修復(fù)中起到重要作用。RACK1是一個具有7個色氨酸-天冬氨酸重復(fù)序列的支架蛋白,在細胞不同區(qū)域分別結(jié)合各種蛋白,從而在許多基本生理過程中都發(fā)揮重要的作用。STMN是一種微管不穩(wěn)定蛋白,存在于胞質(zhì)中,與微管解聚有關(guān)。qRT-PCR分析這3個基因的組織表達譜,結(jié)果顯示BmPCNA基因在絲腺中特異性高表達,BmSTMN基因在絲腺特異性中低表達,而BmRACK1基因在各個組織中均有較高的表達。流式檢測BmPCNA過表達和干涉對細胞周期的影響,結(jié)果顯示過表達BmPCNA后,S期細胞增加,而干涉BmPCNA后,S期細胞減少。推測,過表達BmPCNA抑制DNA的復(fù)制從而導(dǎo)致S期細胞減少;反之,干涉BmPCNA促進DNA的復(fù)制從而引起S期細胞增加。qRT-PCR結(jié)果表明,BmCKI-L處于BmPCNA的上游,并抑制BmPCNA的表達。推測,BmCKI-L可能通過抑制BmPCNA,調(diào)控DNA復(fù)制,從而調(diào)控細胞周期。流式結(jié)果顯示過表達BmRACK1,G1期細胞增加,G2/M期細胞減少;而干涉BmRACK1,G2/M期細胞增加,G1期細胞減少。qRT-PCR結(jié)果表明,BmRACK1可能處于BmCKI-L的上游,并促進BmCKI-L的表達。推測,過表達BmRACK1,引起B(yǎng)mCKI-L表達量上升,從而導(dǎo)致G1期細胞增多,G2/M期細胞減少;反之干涉BmRACK1,降低了BmCKI-L的表達量,使得G2/M期細胞增加,G1期細胞減少。流式結(jié)果顯示,無論過表達還是干涉BmSTMN都會引起G2/M期細胞增加,G1期細胞減少。推測,持續(xù)過表達或干涉BmSTMN,都會導(dǎo)致紡錘體無法順利組裝,從而將細胞周期阻滯在M期。qRT-PCR結(jié)果顯示,BmCKI-L處于BmSTMN的上游,并抑制BmSTMN的表達。推測,BmCKI-L可通過抑制BmSTMN,調(diào)控細胞骨架網(wǎng)絡(luò),從而調(diào)控細胞周期。綜上,我們構(gòu)建了可能的BmCKI調(diào)控細胞周期網(wǎng)絡(luò)。BmCKI可通過多種途徑參與正常有絲分裂周期和絲腺核內(nèi)周期的調(diào)控:BmCKI與cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合并抑制復(fù)合物的活性,參與細胞周期調(diào)控;BmCKI通過結(jié)合并抑制BmPCNA,調(diào)控DNA復(fù)制,參與細胞周期調(diào)控;BmCKI通過結(jié)合并抑制BmSTMN,調(diào)控細胞骨架動力學(xué),參與細胞周期調(diào)控;此外,BmRACK1影響B(tài)mCKI的表達。
【圖文】：

第一章 文獻綜述周期胞周期概述次細胞分裂期結(jié)束開始，經(jīng)過物質(zhì)積累過程，直到下一次細胞稱為一個細胞周期。一個標準的細胞周期可以人為地劃分為先：G1 期、DNA 合成期（S 期）、G2 期和細胞分裂期（M 期）（ DNA 復(fù)制的準備期，主要特點是細胞中大量合成 DNA 復(fù)制所需類和脂質(zhì)等。S 期是細胞周期進程中最重要的一個時期，細胞中 復(fù)制，同時也合成組蛋白及非組蛋白。G2 期是細胞分裂的準備量合成 RNA、ATP 及一些與 M 期結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，形成的基本單位微管蛋白。M 期細胞進行分裂，此期內(nèi)細胞形變化，染色體凝集及分離，核膜、核仁破裂及重建，紡錘體、，繼而細胞核發(fā)生分裂形成兩個子核后，胞質(zhì)一分為二，細胞完成

西南大學(xué)博士學(xué)位論文無法向 G1 期逆轉(zhuǎn)[24]。cyclin A-CDK 復(fù)合物是 S 期最主要的 cyclin-CDK 復(fù)合物，能啟動 DNA 的復(fù)制，并阻止已復(fù)制的 DNA 發(fā)生重復(fù)復(fù)制[25]。G2 期晚期形成的cyclin B-CDK 復(fù)合物在促進 G2 期向 M 期轉(zhuǎn)換的過程中起到關(guān)鍵作用，cyclinB-CDK1 復(fù)合物磷酸化組蛋白 H1、核纖層蛋白等多種蛋白，促進染色質(zhì)凝集，核纖解聚等，從而促使細胞進入 M 期。M 期細胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)上所發(fā)生的變化以及中期向后期、M 期向下一個 G1 期的轉(zhuǎn)化均與 cyclin B-CDK1 復(fù)合物有關(guān)。在有絲分裂后期末，，cyclin B 在激活的 APC 作用下，經(jīng)多聚泛素化途徑被降解，cyclinB-CDK1 復(fù)合物解聚、失活，促使細胞轉(zhuǎn)向末期，此時細胞中因失去 cyclin B-CDK1的活性，磷酸化的組蛋白、核纖層蛋白等可在磷酸酶作用下發(fā)生去磷酸化，染色體又重新開始凝集、核膜也再次組裝，子代細胞核逐漸形成。后期末 cyclin B-CDK1的活性降低，也促進了胞質(zhì)分裂的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S881.2;Q78

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本文編號：2685247