【摘要】：蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)能產(chǎn)生對多種昆蟲具有特異高效毒性的殺蟲蛋白,在全世界農(nóng)林業(yè)害蟲及衛(wèi)生害蟲的防治中發(fā)揮了重要作用。除此之外,近年來,Bt一系列其他的功能也逐漸被發(fā)現(xiàn),包括抑制癌細胞活性、抗病殺菌、促進植物生長、合成金屬納米粒子等。而生物的功能多樣性是由遺傳多樣性所決定的,但是現(xiàn)有的基于遺傳多樣性的分型方法的區(qū)分度不能滿足對菌株進行有效分型的需求,例如16S rDNA序列多樣性分析等。因此本研究基于菌株遺傳多樣性在多個水平對Bt進行了多樣性的分析。首先我們通過對分辨能力以及運算效率等參數(shù)的篩選,獲得了高效的分型算法;在此基礎(chǔ)上建立了一種新的Bt菌株進化分型系統(tǒng),對Bt菌株進行進化分析。進一步,利用功能基因注釋的策略對Bt潛在功能、鞘翅目害蟲殺蟲活性進行分析,并結(jié)合菌株進化分析結(jié)果,研究Bt菌株功能進化的特點。主要結(jié)果如下:(1)Bt新菌株分型系統(tǒng)的建立及進化分析。首先對有基因組完成圖數(shù)據(jù)的少量Bt菌株樣本進行分析,結(jié)果表明Bt的變異在染色體上均勻發(fā)生。接下來我們利用5種常見的標準血清型亞種(aizawai,kurstaki,israelensis,thuringiensis,morrisoni,共23株)Bt菌株對四種分型方法進行了評估,結(jié)果表明,基于保守核心基因堿基序列多樣性的分析方法(多位點序列分型MLST和核心基因序列多樣性分析SCCGPA)對菌株的分辨能力不夠,無法對相同血清型亞種菌株進行有效的分型;而基于基因組組成特征的分析方法(非必需基因位點多樣性分析DGCPA和組分矢量法CVT)能夠?qū)赀M行分辨效果較為理想的分型;并且組分矢量法CVT所需要的運算時間遠遠低于其他分型方法。進一步我們基于CVT建立了Bt菌株進化分型方法,并對190株Bt菌株進行了進化特征以及遺傳多樣性的分析。(2)Bt可變基因潛在功能進化特征分析。可變基因(非必需基因和特有基因)是菌株功能多樣性的遺傳學基礎(chǔ)。Bt和同屬于蠟樣芽胞桿菌種群的B.cereus除了在能否產(chǎn)生殺蟲基因上具有差異外,其進化及遺傳特征極為接近。我們利用功能基因注釋的策略對Bt可變基因中潛在功能活性進行了分析,并結(jié)合菌株進化分析結(jié)果,對Bt潛在功能進化特征進行了研究。首先我們使用泛基因組分析的方法確定了150株Bt菌株及150株B.cereus菌株中的可變基因。結(jié)果共鑒定出38,357個基因家族,其中菌株核心基因家族共239個,占總基因家族的0.62%,可變基因家族共有38,118個,占總基因家族的99.38%。接下來我們對鑒定出的這些可變基因進行了功能基因多樣性的分析。我們利用序列比對的方法對其包含的殺蟲基因以及與新功能相關(guān)的基因(簇)進行了分析。結(jié)果如下,a,在Bt中一共發(fā)現(xiàn)了93類不同的殺蟲基因,大部分的Bt菌株(76%,N=150)均攜帶1-12類不等的殺蟲基因。并且在14株B.cereus菌株中也發(fā)現(xiàn)有攜帶殺蟲基因的現(xiàn)象,這可能是由于污染或質(zhì)粒交換等原因造成的;b,Bt和B.cereus中均存在腸毒素、溶血素、幾丁質(zhì)酶、膠原酶蛋白、羊毛硫細菌素、免疫抑制因子類等與殺線蟲相關(guān)的功能基因(簇),Bt中還存在有殺線蟲活性的殺蟲蛋白基因,并且Bt(53.07%,N=5,851)攜帶數(shù)量多于B.cereus(46.93%,N=5,851)菌株;c,只有Bt菌株4BR1含有一類特有的具有殺螨活性的cry3A類毒素基因;d,Bt和B.cereus中都存在豐原素、表面活性素、伊枯草菌素以及殺鐮孢菌素類等與抗真菌相關(guān)的功能基因(簇),Bt(55.41%,N=1,285)攜帶數(shù)量多于B.cereus(44.59%,N=1,285)菌株;e,Bt和B.cereus中都存在細菌素以及AiiA降解酶類等與抗細菌相關(guān)的功能基因(簇),Bt(54.75%,N=1,989)攜帶數(shù)量多于B.cereus(45.25%,N=1,989);f,Bt和B.cereus中都存在鐵載體、磷酸、多糖、乳酸、脯氨酸、生長素、檸檬酸、琥珀酸、氮代謝信號傳導蛋白、2,3-丁二醇、銨轉(zhuǎn)運載體蛋白、ACC脫氨酶、草酸、氨甲酰轉(zhuǎn)移酶類等與促植物生長相關(guān)的功能基因(簇),另外少數(shù)Bt菌株中還存在生長素輸出載體類基因,某些B.cereus中存在特有的植酸酶基因,總體來說Bt(49.80%,N=16,255)攜帶數(shù)量要少于B.cereus(50.20%,N=16,255);g,Bt和B.cereus中均存在硝酸還原酶類等與合成金屬納米粒子相關(guān)的基因(簇),且Bt(50.97%,N=1,336)攜帶數(shù)量多于B.cereus(49.03%,N=1,336);h,Bt菌株Sbt003以及T13001中攜帶有抑制癌細胞活性的cry65Aa類毒素基因。另外我們通過antiSMASH 3.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測到這些可變基因家族中共存在167個潛在的次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇家族,分為15類(括號里的數(shù)字代表對應(yīng)的數(shù)量),分別為arylpolyene(3),bacteriocin(6),furan(1),ladderane(3),lanthipeptide(37),NRPS(89),NRPS,T1PKS(2),NRPS-like(11),other(1),PKS-like(1),sactipeptide(3),siderophore(3),T1PKS(4),T3PKS(1),terpene(2)。同時KEGG以及COG功能注釋結(jié)果顯示有很大一部分基因目前還沒有明確或已知的功能,以上這些基因可能隱藏了與Bt菌株功能多樣性相關(guān)的重要信息。此外,對150株Bt菌株的功能進化特征分析結(jié)果表明,大部分的功能基因(簇)分布在CladeⅡ(71.93%,N=14,158)中,小部分分布在CladeⅠ(21.83%,N=14,158)中,剩余功能基因(簇)分布在CladeⅢ(5.02%,N=14,158)以及CladeⅣ(1.21%,N=14,158)中。CladeⅠ、CladeⅡ以及CladeⅢ菌株分別攜帶77-102、75-109以及85-100類相關(guān)功能基因(簇),CladeⅣ中的兩株Bt菌株均攜帶86類相關(guān)功能基因(簇)。上述結(jié)果表明Bt具有大量待發(fā)掘的潛在功能基因(簇),因此進一步發(fā)掘Bt新功能并探索推進其在新領(lǐng)域的應(yīng)用,對促進Bt資源高效利用將有重要意義。(3)Bt鞘翅目殺蟲活性進化特征分析。近年來,鞘翅目為害呈上升趨勢。我們通過對相關(guān)文獻及專利數(shù)據(jù)的查詢,對鞘翅目殺蟲蛋白基因進行了統(tǒng)計分析,并結(jié)合菌株進化分析結(jié)果,對Bt鞘翅目殺蟲活性進化特征進行了研究。當前為害較為嚴重的鞘翅目害蟲主要來自葉甲總科和金龜科。a,對金龜子類害蟲有活性的Bt殺蟲蛋白主要有Cry3、Cry7、Cry8、Cry23/37和Vip1/Vip2類,以及來自B.popilliae(A型)的Cry18和來自Paenibacillus lentimorbus(B型)的Cry43;b,對葉甲總科害蟲有活性的Bt殺蟲蛋白主要有Cry1、Cry3、Cry34、Cry34/Cry35、Cry55、Cry6、Cry7、Cry8、Cyt2、Sip、Vip1/Vip2、Vip2類,以及對玉米害蟲玉米根葉甲具有不錯活性的來自Pseudomonas chlororaphis的IPD072Aa蛋白,來自Alcaligenes faecalis的AfIP-1A/1B蛋白,以及來自P.mosselii的PIP-47Aa蛋白。這也給今后鞘翅目害蟲的防治提供了新的視角與思路。此外,150株Bt菌株的鞘翅目殺蟲活性進化特征分析結(jié)果表明,共有45個殺蟲蛋白基因與鞘翅目防治相關(guān),其中大部分分布在CladeⅡ(75.56%,N=45)中,剩余有11個分布在CladeⅠ(24.44%,N=45)中。并且CladeⅡ中有鞘翅目殺蟲活性的基因集中分布在CVTⅡ13(29.41%,N=34)、CVTⅡ3(26.47%,N=34)以及CVTⅡ7-8(17.65%,N=34)類菌株中。(4)金龜子昆蟲的基因組研究。金龜子類害蟲對殺蟲蛋白的耐受性最強。為了探索其耐受機制并提高該類害蟲的防治效果,我們對兩種金龜子類害蟲白星花金龜和大黑鰓金龜進行了基因組研究。首先k-mer分析表明這兩種昆蟲預(yù)估的基因組大小分別為810 Mb以及1.34Gb,雜合度分別為2.35%以及2.17%,表明該兩種昆蟲基因組雜合度較高,均屬于復雜基因組。為了解決雜合度高引起的組裝難題,進一步我們設(shè)計了分層組裝流程,將雜合的等位序列分開進行組裝,保證了組裝質(zhì)量�；谠摲椒�,我們完成了白星花金龜?shù)幕蚪M組裝與注釋,解決了當前白星花金龜研究中基因資源匱乏的窘境,為今后該昆蟲的遺傳研究與防治提供了寶貴的數(shù)據(jù)資源。綜上,本研究基于組分矢量法CVT建立了一種能夠有效反映遺傳特征的新菌株分型系統(tǒng),對Bt菌株進行進化分析。進一步,利用功能基因注釋的策略對Bt潛在功能、鞘翅目害蟲殺蟲活性進行分析,并結(jié)合菌株進化分析結(jié)果,研究了Bt菌株功能進化的特點,相關(guān)結(jié)果表明菌株遺傳特征與功能活性之間具有一定的關(guān)聯(lián)性,為今后推進Bt菌株資源的研究與利用提供基礎(chǔ)。新菌株分型系統(tǒng)CVT能夠有效地分析菌株多樣性,從而有助于進一步去除菌株資源庫中的冗余菌株并篩選可用于基因發(fā)掘的新菌株,提高基因發(fā)掘包括殺蟲基因以及潛在功能基因的效率。此外,為了提高鞘翅目金龜子類害蟲的防治效果,對其中的白星花金龜進行了基因組測序與研究,為進一步從遺傳的角度分析該類害蟲耐受Bt感染的機制奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

in 等人對如何使用基因組數(shù)據(jù)來全面描述菌株特菌株的基因組數(shù)據(jù)，可有些物種仍然會發(fā)現(xiàn)新的種即使再測數(shù)百個基因組也依舊會有新的基因被株基因組特征的概念，“泛基因組 （pan-genome）部基因，由核心基因（core gene）、非必需基因（-specific gene）這三部分組成（圖 1-1）[1]。其中僅在某些菌株（至少兩株）中存在，而菌株特有基因代表某物種中所有能夠編碼該物種基本生物需基因和特有基因等可變基因代表該物種的多樣及對細菌生長并不是必需的但能夠有利于細菌生基因[2]。對非必需基因的研究和功能注釋發(fā)現(xiàn)假多數(shù)歸屬于此類基因，雖然在一個典型的基因組必需基因?qū)ξ锓N的生存和維持并不是必需的，病原菌中，這類基因的減少通常會伴隨著菌株相菌的體外連續(xù)培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，編碼菌毛的基因會發(fā)結(jié)構(gòu)在菌株的定殖中會起到重要的作用。與此相纖毛狀的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)并不是在所有菌株中都關(guān)基因的出現(xiàn)或丟失[4]。

圖 1-2 無乳鏈球菌和炭疽芽胞桿菌的泛基因組特征圖[2]ig. 1-2 Pan-genome analysis of Streptococcus agalactiae and Bacillus anthra基因組分析軟件GAP因組自動化分析軟件（Pangenome Analysis Pipeline，PGAP）[6]是趙永兵等 Perl 語言、應(yīng)用于分析原核生物泛基因組學的自動化分析流程[7]。該流程塊組成，分別是對功能基因的聚類分析、對功能基因遺傳變異的分析、對富集分析、系統(tǒng)發(fā)育分析以及泛基因組的特征分析（圖 1-3）[7]。
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S476
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本文編號：2684575