發(fā)布時(shí)間：2020-05-27 04:59

【摘要】：非我識(shí)別是引發(fā)多細(xì)胞生物(包括植物)先天免疫反應(yīng)的重要現(xiàn)象之一。本研究表明非我識(shí)別的有效利用可引起植物對(duì)病害的持久抗性。本研究不僅成功鑒定了來自傳統(tǒng)中藥材半夏(Pinellia ternata(Thunb.))的可引起煙草超敏反應(yīng)的基因,還將這些基因通過遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到本氏煙(Nicotiana benthamiana Domin)中,增強(qiáng)了本氏煙對(duì)三種不同病原物(灰霉(Botrytis cineria)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)和煙草花葉病毒(TMV))的基礎(chǔ)抗性。本研究利用p TRV表達(dá)載體構(gòu)建了半夏的c DNA文庫,并轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),初步篩選到了49個(gè)能引起煙草超敏反應(yīng)的半夏(pt HR)基因。確認(rèn)了其在本氏煙、番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)和棉花(Gossypium hirsutum L.)葉片中的強(qiáng)過敏性反應(yīng)之后,選取了7個(gè)基因(pt HR293,pt HR759,pt HR1015,pt HR941,pt HR375,pt HR2-20和pt HR99)做進(jìn)一步研究。本研究表明,這7個(gè)pt HR基因在引起煙草超敏性反應(yīng)的同時(shí)會(huì)引發(fā)活性氧爆發(fā)及胼胝質(zhì)沉積等現(xiàn)象。將pt HR基因注射本氏煙的上部葉片0-120小時(shí)后,病程相關(guān)基因(PR-1a,PR-5,PDF-_1.2,NPR1,PAL,RBOHB和ERF-_1)的表達(dá)量會(huì)以24小時(shí)的時(shí)間間隔顯著升高,顯示其可能激活了水楊酸(SA)和茉莉酸/乙烯(JA/ET)介導(dǎo)的防御途徑。在本氏煙的上部葉片表達(dá)這些pt HR基因0-168小時(shí)后,可以以24小時(shí)的時(shí)間間隔增強(qiáng)抗氧化酶(過氧化物酶(POD),多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。本研究將選取的pt HR基因克隆到p CAMBIA3301雙元表達(dá)載體的Bgl Ⅱ和Bst E Ⅱ酶切位點(diǎn)之間,并通過測(cè)序分析確認(rèn)序列的正確插入。將克隆子轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105中后,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系成功獲得了7種正常轉(zhuǎn)化的本氏煙植株(pt HR293,pt HR759,pt HR1015,pt HR941,pt HR375,pt HR2-20和pt HR99)。利用基因特異性引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)化的本氏煙中目標(biāo)基因的陽性整合。將陽性植株的種子在MS培養(yǎng)基上用雙丙氨膦抗生素進(jìn)行篩選后,得到了T_1代植株。利用RT-PCR和q RT-PCR檢測(cè)pt HR基因的表達(dá)直至T_3代轉(zhuǎn)化的本氏煙。在轉(zhuǎn)化的本氏煙中,T_3代植株中病程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組水平為非轉(zhuǎn)化植株的1.14至34.02倍,表明了其對(duì)下一代的抗性遺傳。轉(zhuǎn)化的本氏煙顯示出抗氧化酶(POD,PPO和SOD)活性的百分比增加,其值分別高達(dá)66.5%,222.3%和134.4%。這些轉(zhuǎn)化的植株還對(duì)灰霉(69.83%)和辣椒疫霉(23.08%)表現(xiàn)出高抗性水平。研究結(jié)果顯示,在本氏煙中引入pt HR基因顯示對(duì)植株的種子萌發(fā),根和芽的生長(zhǎng)沒有副作用。UPLC-QTOF-MS分析顯示,轉(zhuǎn)化的本氏煙植株中的一些生物活性化合物顯著被誘導(dǎo),可能與抗性增強(qiáng)有關(guān)。這些生物活性化合物是pt HR293轉(zhuǎn)化株系中的乙氧唑胺,吡咯烷,二十四烷,3,4-二氯馬來酰亞胺,磺胺和2-十一烷酮;pt HR375轉(zhuǎn)化株系中的土霉素,引誘酮,羥哌氟丙嗪,尿囊素,己烯雌酚和1,2-苯并異噻唑-3(2H)-酮;以及pt HR99轉(zhuǎn)化株系中的哌咪清,水楊酸異戊酯,1,3-丁二烯和香茅醛。F-_1代雜交植株(pt HR941-F-_1,pt HR375-F-_1,pt HR1015-F-_1,pt HR941+pt HR375-F-_1和pt HR293+pt HR759-F-_1)是通過將轉(zhuǎn)化的(T_3)與未轉(zhuǎn)化的植株雜交,以及一種基因轉(zhuǎn)化的T_3代與另一種基因轉(zhuǎn)化的T_3代雜交得到的。與它們各自的對(duì)照植株相比,這些雜交植株表現(xiàn)出病程相關(guān)基因的高表達(dá)水平(高達(dá)20.01倍)。在抗性分析中發(fā)現(xiàn),這些雜交植株具有穩(wěn)定的高抗病性,對(duì)灰霉和辣椒疫霉的抑制率分別高達(dá)42.38%和30.62%。通過本研究可以得出以下結(jié)論:異源植物基因可以激發(fā)植物對(duì)病害的抗性;通過產(chǎn)生F-_1雜交植株,可以獲得新的非病原物誘導(dǎo)的抗性;pt HR基因可在SA和JA/ET防御途徑中發(fā)揮作用,從而激發(fā)植物對(duì)入侵病原物的抗性。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S567.239;S435.72
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本文編號(hào)：2682992