【摘要】：非我識別是引發(fā)多細胞生物(包括植物)先天免疫反應的重要現(xiàn)象之一。本研究表明非我識別的有效利用可引起植物對病害的持久抗性。本研究不僅成功鑒定了來自傳統(tǒng)中藥材半夏(Pinellia ternata(Thunb.))的可引起煙草超敏反應的基因,還將這些基因通過遺傳轉化導入到本氏煙(Nicotiana benthamiana Domin)中,增強了本氏煙對三種不同病原物(灰霉(Botrytis cineria)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)和煙草花葉病毒(TMV))的基礎抗性。本研究利用p TRV表達載體構建了半夏的c DNA文庫,并轉入到根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。利用農桿菌介導的瞬時表達系統(tǒng),初步篩選到了49個能引起煙草超敏反應的半夏(pt HR)基因。確認了其在本氏煙、番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)和棉花(Gossypium hirsutum L.)葉片中的強過敏性反應之后,選取了7個基因(pt HR293,pt HR759,pt HR1015,pt HR941,pt HR375,pt HR2-20和pt HR99)做進一步研究。本研究表明,這7個pt HR基因在引起煙草超敏性反應的同時會引發(fā)活性氧爆發(fā)及胼胝質沉積等現(xiàn)象。將pt HR基因注射本氏煙的上部葉片0-120小時后,病程相關基因(PR-1a,PR-5,PDF-_1.2,NPR1,PAL,RBOHB和ERF-_1)的表達量會以24小時的時間間隔顯著升高,顯示其可能激活了水楊酸(SA)和茉莉酸/乙烯(JA/ET)介導的防御途徑。在本氏煙的上部葉片表達這些pt HR基因0-168小時后,可以以24小時的時間間隔增強抗氧化酶(過氧化物酶(POD),多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。本研究將選取的pt HR基因克隆到p CAMBIA3301雙元表達載體的Bgl Ⅱ和Bst E Ⅱ酶切位點之間,并通過測序分析確認序列的正確插入。將克隆子轉化到根癌農桿菌EHA105中后,利用農桿菌介導的遺傳轉化體系成功獲得了7種正常轉化的本氏煙植株(pt HR293,pt HR759,pt HR1015,pt HR941,pt HR375,pt HR2-20和pt HR99)。利用基因特異性引物進行的PCR反應進一步證實了轉化的本氏煙中目標基因的陽性整合。將陽性植株的種子在MS培養(yǎng)基上用雙丙氨膦抗生素進行篩選后,得到了T_1代植株。利用RT-PCR和q RT-PCR檢測pt HR基因的表達直至T_3代轉化的本氏煙。在轉化的本氏煙中,T_3代植株中病程相關基因的轉錄組水平為非轉化植株的1.14至34.02倍,表明了其對下一代的抗性遺傳。轉化的本氏煙顯示出抗氧化酶(POD,PPO和SOD)活性的百分比增加,其值分別高達66.5%,222.3%和134.4%。這些轉化的植株還對灰霉(69.83%)和辣椒疫霉(23.08%)表現(xiàn)出高抗性水平。研究結果顯示,在本氏煙中引入pt HR基因顯示對植株的種子萌發(fā),根和芽的生長沒有副作用。UPLC-QTOF-MS分析顯示,轉化的本氏煙植株中的一些生物活性化合物顯著被誘導,可能與抗性增強有關。這些生物活性化合物是pt HR293轉化株系中的乙氧唑胺,吡咯烷,二十四烷,3,4-二氯馬來酰亞胺,磺胺和2-十一烷酮;pt HR375轉化株系中的土霉素,引誘酮,羥哌氟丙嗪,尿囊素,己烯雌酚和1,2-苯并異噻唑-3(2H)-酮;以及pt HR99轉化株系中的哌咪清,水楊酸異戊酯,1,3-丁二烯和香茅醛。F-_1代雜交植株(pt HR941-F-_1,pt HR375-F-_1,pt HR1015-F-_1,pt HR941+pt HR375-F-_1和pt HR293+pt HR759-F-_1)是通過將轉化的(T_3)與未轉化的植株雜交,以及一種基因轉化的T_3代與另一種基因轉化的T_3代雜交得到的。與它們各自的對照植株相比,這些雜交植株表現(xiàn)出病程相關基因的高表達水平(高達20.01倍)。在抗性分析中發(fā)現(xiàn),這些雜交植株具有穩(wěn)定的高抗病性,對灰霉和辣椒疫霉的抑制率分別高達42.38%和30.62%。通過本研究可以得出以下結論:異源植物基因可以激發(fā)植物對病害的抗性;通過產生F-_1雜交植株,可以獲得新的非病原物誘導的抗性;pt HR基因可在SA和JA/ET防御途徑中發(fā)揮作用,從而激發(fā)植物對入侵病原物的抗性。
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S567.239;S435.72
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本文編號：2682992