【摘要】：國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),寄主植物可調(diào)控植食性昆蟲對(duì)病毒的易感性,但導(dǎo)致這種易感性差異的機(jī)理尚不明確。因此本研究以植物(黃豆、甘藍(lán)和蕹菜)、(甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和甜菜夜蛾核型多角體病毒(Spodoptera exigua multicapsid nucleopolyhedrovirus,SeMNPV)為研究對(duì)象,運(yùn)用生態(tài)學(xué)、生理以及分子技術(shù)手段,試圖揭示植物調(diào)控植食性昆蟲對(duì)病毒的易感性差異的機(jī)理。主要結(jié)果如下:1.取食不同寄主植物的甜菜夜蛾,在感染病毒后的12h、24h、36h、48h、72h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn),血淋巴中病毒增殖和血淋巴黑化率有明顯差異。取食不同食物的幼蟲在感毒處理后病毒增殖量大小依次為:黃豆人工飼料甘藍(lán)蕹菜,病毒增值數(shù)量隨著感毒后時(shí)間的延長(zhǎng)呈指數(shù)上升;取食蕹菜和甘藍(lán)的幼蟲血淋巴黑化率顯著高于取食黃豆的幼蟲。黑化率與病毒增殖量可用指數(shù)關(guān)系模型擬合,感毒幼蟲的血淋巴黑化率與病毒的增殖量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,即血淋巴黑化率隨病毒增殖量的增加而降低。表明不同寄主植物可能影響了宿主的黑化反應(yīng)而導(dǎo)致血淋巴中病毒增殖量的不同。2.為探明黑化水平差異的機(jī)理,測(cè)定了黑化反應(yīng)關(guān)鍵酶(酚氧化酶(phenoloxidase,PO)、多巴脫羧酶(Dopa decarboxylase,DDC)和酪氨酸羥化酶(tyrosine 3-monooxygenase,TH))的活性。未感病甜菜夜蛾幼蟲取食4種食物后,其血淋巴多巴脫羧酶、酚氧化酶和酪氨酸羥化酶活性有顯著差異,且隨著時(shí)間延長(zhǎng),三種酶活性均表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。感毒處理組中,取食蕹菜的幼蟲血淋巴中酚氧化酶活性最高,黃豆最低,人工飼料和甘藍(lán)次之,多巴脫羧酶和酪氨酸羥化酶活性也有相同現(xiàn)象。相關(guān)性分析表明,黑化反應(yīng)關(guān)鍵酶活性與黑化率呈正相關(guān)關(guān)系,與病毒增殖量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。表明多巴脫羧酶、酚氧化酶和酪氨酸羥化酶協(xié)同參與甜菜夜蛾的黑化反應(yīng),取食蕹菜和甘藍(lán)的幼蟲通過體液免疫抗病毒的能力高于黃豆。3.在測(cè)定酶活性的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步測(cè)定了黑化反應(yīng)關(guān)鍵酶(酚氧化酶、多巴脫羧酶和酪氨酸羥化酶)基因的轉(zhuǎn)錄水平。取食不同食物的甜菜夜蛾幼蟲感毒處理后三種酶的基因表達(dá)量變化趨勢(shì)與酶活性基本一致,均是先升高后降低。感毒處理組多巴脫羧酶、酚氧化酶和酪氨酸羥化酶活性,均是蕹菜處理最高,人工飼料和甘藍(lán)次之,黃豆最低。各感毒處理組酚氧化酶基因相對(duì)表達(dá)量在24h最高,而多巴脫羧酶和酪氨酸羥化酶兩種酶的基因相對(duì)表達(dá)量在36h最高,且各處理組中差異顯著;取食蕹菜的幼蟲在感毒后12-72h的多巴脫羧酶、酚氧化酶和酪氨酸羥化酶基因表達(dá)量均顯著高于取食黃豆;說明寄主植物可能通過調(diào)控感毒幼蟲體內(nèi)黑化反應(yīng)關(guān)鍵酶的基因表達(dá)量影響了酶的活性。4.從細(xì)胞免疫入手,探究寄主植物對(duì)甜菜夜蛾感染核型多角體病毒后細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明,取食4種食物的未感毒宿主幼蟲的細(xì)胞凋亡率均較低,但感染病毒后的宿主細(xì)胞凋亡率迅速升高,且在同一種食物上的不同時(shí)間點(diǎn)的凋亡率差異性極顯著,同一時(shí)間點(diǎn)的四種食物處理間亦存在顯著性差異,均表現(xiàn)為蕹菜和甘藍(lán)處理組細(xì)胞凋亡率顯著大于黃豆和人工飼料處理。說明取食蕹菜和甘藍(lán)的幼蟲其細(xì)胞免疫力高于黃豆。幼蟲血細(xì)胞凋亡率與體內(nèi)病毒的相對(duì)增殖量呈正相關(guān)關(guān)系,可用指數(shù)關(guān)系模型較好地?cái)M合。5.取食4種食物的甜菜夜蛾幼蟲感染病毒后12-72h,促使細(xì)胞發(fā)生凋亡的甜菜夜蛾半胱天冬酶(caspase)基因相對(duì)表達(dá)量顯著上升,細(xì)胞凋亡抑制子(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)基因相對(duì)表達(dá)量下降。取食蕹菜和甘藍(lán)組,半胱天冬酶基因表達(dá)量顯著高于黃豆和人工飼料;取食黃豆的宿主凋亡抑制子基因相對(duì)表達(dá)量高于蕹菜與甘藍(lán)。細(xì)胞凋亡率與半胱天冬酶基因的表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系,與甜菜夜蛾細(xì)胞凋亡抑制子(Se-IAP)基因相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,說明寄主植物調(diào)控甜菜夜蛾半胱天冬酶和凋亡抑制子基因表達(dá)在參與甜菜夜蛾細(xì)胞凋亡反應(yīng)中有著重要作用。研究結(jié)果為探究寄主植物影響感毒幼蟲細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供了參考。本研究證實(shí),感毒和寄主植物的互作顯著影響甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)甜菜夜蛾核型多角體病毒的增殖、黑化反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果從宿主免疫角度解析了植物調(diào)控植食性昆蟲對(duì)病毒的易感性機(jī)理,為植物、昆蟲和病毒相互作用的關(guān)系研究積累了思路與方法。
【圖文】：

圖 3-2 基因的擴(kuò)增曲線Figure 3-2 The amplification curve of (Se-PPO、Se-DDC 和 Se-TH)genes注：a: Se-β-actin 基因的擴(kuò)增曲線；b: Se-PPO基因的擴(kuò)增曲線；c: Se-DDC 基因的擴(kuò)增曲線；d: Se-TH 基因的擴(kuò)增曲線.Note: a: The amplification curve of Se-β-actin gene; b: The amplification curve of Se-PPO gene;c: The amplification curve of Se-DDC gene; d: The amplification curve of Se-TH gene.目的基因（Se-PPO、Se-DDC 和 Se-TH）和內(nèi)參基因（Se-β-actin）的擴(kuò)增曲線傾斜程度基本一致，擴(kuò)增效率較高（圖 3-2）�；虻娜劢馇�為單峰，且Se-PPO、Se-DDC 和 Se-TH 基因的溶解曲線 Tm 值在各目的片段 Tm 值范圍內(nèi)，說明產(chǎn)物單一，，無引物二聚體（圖 3-3）。該結(jié)果表明了引物特異性強(qiáng)，可進(jìn)行熒光定量分析。

23圖 3-3 基因的熔解曲線Figure 3-3 The melt curve of (Se-PPO、Se-DDC 和 Se-TH)genes注：a: Se-β-actin 基因的熔解曲線；b: Se-PPO基因的熔解曲線；c: Se-DDC 基因的熔解曲線；d: Se-TH 基因的熔解曲線.Note: a: The melt curve of Se-β-actin gene; b: The melt curve of Se-PPO gene;c: The melt curve of Se-DDC gene; d: The melt curve of Se-TH gene;PO、DDC 和 TH 三種酶活性和相應(yīng)的基因表達(dá)量的指數(shù)關(guān)系模型表明：血中 PO、DDC 和 TH 三種酶活性與相應(yīng)的基因表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系，酶活性應(yīng)基因表達(dá)量的上升而上升( 圖 3-3 ) 。甜菜夜蛾幼蟲的血淋巴黑化率與 DDC、PO和 TH三種酶活性和基因表達(dá)量指數(shù)關(guān)系模型表明，感毒幼蟲的血淋巴黑化率隨著多巴脫羧酶、酚氧化酶、酪酸羥化酶活性和相應(yīng)的基因表達(dá)量的上升而上升 ( 圖 3-4 )。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S476;S433.4

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本文編號(hào)：2680227