發(fā)布時間：2020-05-24 01:53

【摘要】：microRNAs(miRNAs)是一類內源性功能小RNA,在動物中廣泛參與細胞分化、發(fā)育形態(tài)、神經系統(tǒng)發(fā)育、肌肉的發(fā)育和維持細胞存活等方面的調控,主要在轉錄后水平通過降解靶基因mRNA、抑制翻譯等作用機制調控基因表達。蠶絲蛋白基因的表達不僅有轉錄因子的協(xié)同參與,而且還和miRNAs在轉錄后水平的調控有著密切的聯系。雖然有很多蠶絲蛋白合成調控機制的報道,但其精密的調控機制尚未完全清晰。研究家蠶miRNAs對蠶絲蛋白表達的調控作用,有助于深入了解miRNAs的功能,并為闡明蠶絲蛋白合成調控的分子機制提供新的實驗數據。本研究以家蠶絲素輕鏈基因為靶基因,采用生物信息學分析獲得2個候選miRNAs,即miR-2805和miR-0031-3p;在半定量RT-PCR進行表達水平分析的基礎上,分別構建靶基因和miRNAs的重組表達載體,利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)和qRT-PCR技術,分別在細胞、離體組織和個體水平分析miRNAs對靶基因的調控作用,取得以下主要結果。1、生物信息學預測到2個調控BmFib-L表達的候選家蠶miRNA從miRBase下載家蠶miRNAs和本實驗室前期測序獲得可能參與蠶絲蛋白調控的35個新家蠶miRNAs,利用生物信息學軟件RNAhybrid分析,根據miRNA5’端的第2-8堿基(種子序列)與靶位點的配對水平和折疊自由能-20.0kcal/mol的原則,篩選出2個對BmFib-L具有潛在調控作用的候選家蠶miRNA,即miR-2805和miR-0031-3p,進行后續(xù)的驗證實驗。2、建立了一種TC-100培養(yǎng)基體外培養(yǎng)絲腺組織進行基因瞬時表達分析的方法取健康家蠶5齡2 d幼蟲,解剖獲取絲腺組織,放入含有800μL TC-100培養(yǎng)基的12孔細胞培養(yǎng)板中,每孔4條絲腺,27℃培養(yǎng)。將構建的含有綠色熒光蛋白的表達載體pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40]用EntransterTM-H4000試劑轉染到絲腺組織中,48 h后用熒光顯微鏡觀察,培養(yǎng)基清澈,絲腺組織外形完好、發(fā)出亮綠色熒光,表明egfp在絲腺中得到了表達,離體培養(yǎng)絲腺組織進行基因瞬時表達是可行的。該方法的建立為研究蠶絲蛋白基因表達調控的分子機制提供新的技術途徑,也為家蠶其他組織的體外培養(yǎng)和研究提供借鑒。3、組織和個體水平證實miR-2805顯著上調BmFib-L基因的表達從NCBI中下載miR-2805的前體序列(pre-miR-2805)和BmFib-L 3’UTR序列,分別構建pre-miR-2805的表達載體pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-2805-SV40]和BmFib-L 3’UTR重組質粒pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3'UTR-SV40],共轉染BmN細胞,檢測miR-2805對BmFib-L調控功能;再用人工合成miR-2805的模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor),進一步驗證miR-2805的功能,結果顯示,miR-2805在卵巢來源的BmN細胞中,通過與BmFib-L 3'UTR結合負調控其表達。為了驗證miR-2805在家蠶體內對BmFib-L表達的調控作用,分別采用5齡幼蟲絲腺離體培養(yǎng)和體腔注射的方法,進行過表達或抑制內源性表達,熒光定量分析結果顯示,miR-2805在離體培養(yǎng)絲腺和幼蟲體內都具有顯著上調BmFib-L表達的作用。4、證實miR-2805通過上調BmAwh和Bmdimm的表達間接調控BmFib-L的表達為了明確細胞和組織及個體水平差異的原因,根據NCBI數據庫中轉錄因子(TF)SGF-1、SGF-3、MBF1、FMBP-1、BmAwh和Bmdimm的序列,設計引物;以上述個體注射處理幼蟲RNA為模板,A3為內參,qRT-PCR技術定量分析了體內過表達miR-2805或抑制表達后,絲腺細胞特異性轉錄因子的表達水平。結果顯示,miR-2805能促進BmAwh和Bmdimm的表達。而且生物信息學分析顯示miR-2805能結合BmAwh的CDS區(qū)和Bmdimm的5’UTR。因此,我們推測miR-2805通過BmAwh和Bmdimm間接上調BmFib-L基因的表達。5、體內體外實驗證實miR-0031-3p抑制BmFib-L基因的表達按照上述同樣的方法,構建miR-0031-3p表達載體,并人工合成miR-0031-3p的mimic、mimic negative、inhibitor和inhibitor negative。在細胞水平進行過表達和抑制內源性表達驗證,結果顯示miR-0031-3p抑制BmFib-L基因表達。并進一步在組織水平進行抑制功能驗證,將miR-0031-3p的inhibitor及其negative control轉染到放有絲腺組織的培養(yǎng)孔中,熒光定量PCR檢測靶基因BmFib-L的表達量。結果顯示,inhibitor抑制miR-0031-3p的作用,促使BmFib-L的表達量上升,即miR-0031-3p能夠下調BmFib-L的表達。采用5齡2d幼蟲體腔注射方法進行體內驗證,結果再次表明,miR-0031-3p抑制BmFib-L 3’UTR基因的表達。研究結果有利于深入理解家蠶miRNA的功能,為蠶絲蛋白表達調控分子機理提供新的實驗數據。
【圖文】：

18圖 2.1 bmo-miRNAs 與 BmFib-L 3' UTR 靶點的預測結果Fig 2.1 Target prediction on BmFib-L 3' UTR of bmo-miRNAs miRNAs 的成熟體驗證 3 d 幼蟲后部絲腺總 RNA 為模板，反轉錄后合成第一鏈 為模板，以成熟體的特異性引物進行 PCR 擴增，得到的（圖 2.2A）。測序結果與 miRBase 數據庫和宋菲測序獲得對，結果顯示，miR-2805 和 miR-0031-3p 的序列正確(圖確，可用于后續(xù)實驗。但是，經過多次測序，仍是無法列。所以選取 miR-2805 和 miR-0031-3p 進行后面的實驗

圖 4.3 BmFib-L 基因的標準曲線Fig 4.3 Standard curve of the BmFib-L gene-2805 在組織水平促進 BmFib-L 的表達巢來源的家蠶 BmN 細胞中，miR-2805 能夠抑制 BmFib-L 的織中情況如何呢？為此，我們用 TC-100 培養(yǎng)基體外培養(yǎng)家蠶，設置過表達研究的三組處理，，轉染 48h 后提取總 RNA，進顯示，mimic 和表達載體 pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-mir-2805-SV數相接近，均極顯著高于陽性對照組。結果表明，在絲腺組 對 BmFib-L 基因的表達具有促進作用（圖 4.4）。再次為體外試驗提供理論數據
【學位授予單位】：江蘇科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S881.26

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本文編號：2678279