【摘要】：隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展,測序質(zhì)量與通量不斷提高,成本迅速下降,轉(zhuǎn)錄組學研究進入了黃金發(fā)展時期。為了更進一步地了解非模式生物,本文基于最新數(shù)據(jù)庫與高被引工具構(gòu)建了一套轉(zhuǎn)錄組分析流程,并利用此流程分析了實驗室4個棉鈴蟲Helicoverpa armigera抗性品系與1種敏感品系的差異表達基因。研究的主要結(jié)果如下:1.5個品系的測序數(shù)據(jù)結(jié)果均得到2000萬以上的reads,平均74億bp的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),過濾后堿基質(zhì)量均達到Q30以上。2.使用5種方法對Trinity拼接得到的234808條轉(zhuǎn)錄本進行質(zhì)量檢測,N50為928bp,Bowtie2回貼比對率均在98%以上,Ex90N50為2042bp,BUSCO檢測到95%的昆蟲保守基因。蛋白庫Nr、Uniprot、Pfam比對的結(jié)果中Diamond優(yōu)于Blast。Nr庫比對結(jié)果有47%的轉(zhuǎn)錄本序列比對到棉鈴蟲,21%比對到煙草夜蛾,還比對到了家蠶、斜紋夜蛾、二化螟等鱗翅目昆蟲。3.組內(nèi)生物學重復(fù)Pearson相關(guān)系數(shù)接近0.9,組間聚類與PCA分析均各自聚在一起,無批次效應(yīng)。4.使用DESeq2和edgeR軟件分別對Salmon、RSEM得到的表達矩陣進行差異分析,結(jié)果edgeR與Salmon的組合得到差異表達基因數(shù)量最多。5.DU品系共得到1156個差異表達轉(zhuǎn)錄本,397個可以對應(yīng)到RefSeq ID,GO分析有5個基因與氨肽酶活性有關(guān),12個基因影響蛋白酶活性,2個基因相應(yīng)抗菌免疫過程;KEGG分析有10個基因參與了肽酶通路。6.LFC2品系共得到995個差異表達轉(zhuǎn)錄本,268個可以對應(yīng)到RefSeq ID,GO分析有4個基因與蛋白激酶抑制劑活性有關(guān),6個基因影響跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性,3個基因與蛋白酶體變化有關(guān);KEGG分析有5個基因在蛋白酶激活受體信號通路發(fā)揮作用,3個基因參與了蛋白酶體通路。7.XXCAD品系共得到982個差異表達轉(zhuǎn)錄本,278個可以對應(yīng)到RefSeq ID,GO分析有8個基因與前體代謝物的產(chǎn)生有關(guān),3個基因與蛋白酶體有關(guān),3個基因與糖基轉(zhuǎn)移酶有關(guān);KEGG分析有6個基因富集在細胞色素P450代謝通路和藥物代謝通路。8.RS品系共得到1201個差異表達轉(zhuǎn)錄本,281個可以對應(yīng)到RefSeq ID,GO分析有15個基因與ATP代謝過程相關(guān),12個基因可以調(diào)節(jié)ATP的活性,有7個基因與前體代謝物的產(chǎn)生相關(guān),2個基因參與膽固醇運輸途徑,3個基因參與脂肪轉(zhuǎn)運途徑,12個基因與核苷酸代謝途徑相關(guān);KEGG分析有2個基因富集到糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白通路,2個基因富集到蛋白酶體通路,9個基因富集到肽酶通路。
【圖文】：

cDNA 文庫構(gòu)建及測序RNA樣品檢測合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。隨后加入fragmer 將 mRNA 打斷成短片段，，以 mRNA 為模板，用六堿基隨機引物合成一鏈 c加入緩沖液、dNTPs 和 DNA polymerase I 和 RNase H 合成二鏈 cDNA，ure XP beads 進行純化。純化的雙鏈 cDNA 先進行末端修復(fù)、加 A 尾并連接再用 AMPure XP beads 進行片段大小選擇。最后進行 PCR 擴增，并用 AMP 純化 PCR 產(chǎn)物，得到最終的文庫。利用 Illumina Hiseq 4000 或 Miseq 測序庫，將初始的圖像信息經(jīng)過 Base calling 轉(zhuǎn)為序列數(shù)據(jù)，即原始測序數(shù)據(jù)（raw 原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制下機的測序數(shù)據(jù)以 Fastq 格式存儲，F(xiàn)astq 文件格式如圖 1。

圖 2 全部樣本堿基質(zhì)量Fig. 2 Base quality scores in all samples2 拼接轉(zhuǎn)錄本質(zhì)量檢測2.1 N50 統(tǒng)計指標總共拼接得到 234808 條轉(zhuǎn)錄本，基于所有轉(zhuǎn)錄本的 N50 為 2243，表示至上序列拼接得到的長度為 2243bp。另外還有一個基于最長轉(zhuǎn)錄本亞型form）的 N50 為 928bp，這個值減少了因拼接得到太多轉(zhuǎn)錄本亞型而產(chǎn)生的更適合說明拼接完整性問題。一般 Longest isoform N50 在 1000bp 左右都是此結(jié)果表示拼接的完整性較好。2.2 回貼比對
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S435.622.3

【參考文獻】

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1 侯麗;詹帥;周欣;李飛;王憲輝;;中國昆蟲基因組學的研究進展[J];應(yīng)用昆蟲學報;2017年05期

2 張傳溪;;中國農(nóng)業(yè)昆蟲基因組學研究概況與展望[J];中國農(nóng)業(yè)科學;2015年17期

3 陳勇;柳亦松;曾建國;;植物基因組測序的研究進展[J];生命科學研究;2014年01期

4 劉紅亮;鄭麗明;劉青青;權(quán)富生;張涌;;非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究[J];遺傳;2013年08期

5 王曦;汪小我;王立坤;馮智星;張學工;;新一代高通量RNA測序數(shù)據(jù)的處理與分析[J];生物化學與生物物理進展;2010年08期

6 滕曉坤;肖華勝;;基因芯片與高通量DNA測序技術(shù)前景分析[J];中國科學(C輯:生命科學);2008年10期

7 梁革梅,譚維嘉,郭予元;人工飼養(yǎng)棉鈴蟲技術(shù)的改進[J];植物保護;1999年02期

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1 尹傳林;二化螟抗藥性相關(guān)基因家族分析及數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2016年

2 陳二虎;柑桔粉虱轉(zhuǎn)錄組分析及抗逆基因的鑒定研究[D];西南大學;2014年

本文編號：2674314