【摘要】：本研究利用華南農(nóng)業(yè)大學(xué)以日本晴為受體轉(zhuǎn)化藥用野生稻抗逆相關(guān)TAC克隆獲得的栽培稻材料,包括:1、轉(zhuǎn)化隨機(jī)TAC克隆獲得的高世代(T10)TDF系列穩(wěn)定株系和低世代(T3-T5)TR系列材料;2、轉(zhuǎn)化基于DREB保守序列篩選的TAC克隆高世代(T10)D系列穩(wěn)定株系;3、分別轉(zhuǎn)化基于NBS-LRR、STK和NAC保守序列篩選的TAC克隆獲得的低世代(T3-T5)NBS-LRR系列材料、STK系列材料和NAC系列材料;通過轉(zhuǎn)化株系目標(biāo)TAC克隆的分子標(biāo)記鑒定、稻瘟病菌株抗性鑒定和抗性遺傳分析,以期明確轉(zhuǎn)化株系的稻瘟病抗性水平與抗性遺傳基礎(chǔ),為進(jìn)一步挖掘利用藥用野生稻抗性基因,培育抗瘟水稻品種奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:人工接種D系列葉瘟鑒定30個(gè)D系列株系對(duì)55個(gè)菌株均有抗性,其中有14個(gè)廣抗譜株系,抗性水平較高,抗譜比例為65.4%~86.7%,占鑒定總株數(shù)的46.67%,16個(gè)中抗譜株系,抗譜比例為42.6%~63%;人工穗瘟接種26個(gè)D系列株系,8個(gè)株系抗譜范圍廣,抗譜比例為66.7%~85.7%,抗穗瘟能力強(qiáng),4個(gè)中抗譜材料的抗譜比例為40.0%~60.0%,D40株系抗穗瘟能力最弱。選取14個(gè)經(jīng)鑒定抗病性強(qiáng)的D系列株系經(jīng)田間病圃自然誘發(fā),6個(gè)株系抗葉瘟表現(xiàn)0~2級(jí)。13個(gè)株系抗穗瘟表現(xiàn)0~2級(jí),其中D4-2×LTH表現(xiàn)高抗穗瘟,抗病等級(jí)為0級(jí)。15個(gè)TDF系列株系對(duì)55個(gè)菌株均有抗性,其中6個(gè)廣抗譜株系,抗葉瘟能力強(qiáng),9個(gè)中抗譜材料,占總鑒定株數(shù)的65.67%,但TDF12株系較弱;TDF株系對(duì)穗瘟接種的菌株抗性存在差異,其中7個(gè)株系對(duì)GD09-3全抗病,5個(gè)株系對(duì)HB6全抗病;對(duì)GW3、FJ3和SH4表現(xiàn)為部分抗病,抗/總株數(shù)≥0.71。NBS-LRR系列株系對(duì)接種的8個(gè)菌株抗葉瘟性存在差異,其中有112個(gè)株系對(duì)HB1菌株抗性最強(qiáng),抗病平均等級(jí)≤1級(jí),83個(gè)株系對(duì)GD09-12菌株表現(xiàn)出較高抗性,對(duì)GW6、HB5、HB6、jj01-1和FJ10菌株表現(xiàn)出抗瘟性,抗/總株系數(shù)≤0.75。STK系列對(duì)GW6、GW3、HB4、FJ10菌株表現(xiàn)高抗葉瘟性,抗/總株數(shù)比范圍:0.54~0.83,但對(duì)jj01-1菌株沒有抗葉瘟性,均表現(xiàn)為感病。NAC系列株系對(duì)GW6和GD09-12菌株的抗葉瘟性較強(qiáng),抗/總株系數(shù)0.79,對(duì)HB8、HB4和HB6菌株有一定的抗性,接種HB5、jj01-1、HB1和FJ10菌株感病株系較多,抗/總株系數(shù)較小。利用TAC載體攜帶的HPT和SacB抗性標(biāo)記基因?qū)?0個(gè)D系列和12個(gè)TDF系列進(jìn)行抗性檢測(cè),均能擴(kuò)增出目標(biāo)TAC載體攜帶的目的基因條帶。35個(gè)T3代NBS-LRR系列株系,有16個(gè)株系擴(kuò)增出目的條帶;100個(gè)T4代株系,有92個(gè)株系材料擴(kuò)增目的條帶;篩選出74個(gè)株系純合株系,182個(gè)T5代株系,有170個(gè)株系擴(kuò)增出目的條帶,篩選出159個(gè)純合株系。76個(gè)T3代STK系列株系,有15個(gè)株系擴(kuò)增出目的條帶;45個(gè)T4株系,有37個(gè)株系擴(kuò)增出目的條帶,純合株系有11個(gè);54個(gè)T5代株系,45個(gè)株系擴(kuò)增出目的條帶,篩選出39個(gè)純合株系。38個(gè)T3代NAC系列株系,有13個(gè)株系擴(kuò)增出目的條帶;45個(gè)T4代株系,均能擴(kuò)增出目的條帶,純合株系有45個(gè);36個(gè)T5代株系,34個(gè)株系擴(kuò)增出目的條帶,篩選出31個(gè)純合株系,表明5個(gè)選用基于轉(zhuǎn)錄因子保守序列篩選的藥用野生稻TAC克隆轉(zhuǎn)化水稻株系,從T3至T5代篩選出的純合抗病株系逐漸增加,T5代基本上達(dá)到純合,均表現(xiàn)出較好的抗病能力,并且抗性趨于穩(wěn)定,鑒定出目的基因數(shù)量逐漸增加,DREB、STK、NBS-LRR和NAC類轉(zhuǎn)錄因子分別成功轉(zhuǎn)入這幾個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中,可能作為正向調(diào)控因子參與轉(zhuǎn)基因株系的廣譜抗病效應(yīng),促進(jìn)其抗稻瘟病能力顯著增強(qiáng)。篩選高世代穩(wěn)定抗病轉(zhuǎn)基因株系D1、D4-1、D4-2和D38與LTH配組鑒定F_2。以HB5菌株接種D1×LTH和D4-1×LTH、以HB8菌株接種D4-1×LTH和D4-2×LTH,對(duì)葉瘟的抗感分離比符合3:1,表明D1、D4-1和D4-2對(duì)上述菌株的葉瘟抗性受1對(duì)顯性基因或顯性QTL位點(diǎn)控制;以HB8接種D1×LTH,對(duì)葉瘟的抗感分離比符合15:1,表明D1對(duì)HB8菌株的葉瘟抗性受2對(duì)顯性基因控制;以HB5菌株接種D4-2×LTH,抗感分離比符合13:3;以HB5和HB8菌株分別接種D38×LTH,抗感分離比均符合9:7;這表明D4-2對(duì)HB5菌株、D38對(duì)HB5和HB8菌株的葉瘟抗性均與兩對(duì)互作基因控制有關(guān)。以HB5菌株和HB8菌株接種D1×LTH、D4-1×LTH、D4-2×LTH和D38×LTH,穗瘟的抗感分離比符合3:1,表明D1、D4-1和D4-2和D38對(duì)上述菌株的葉瘟抗性受1對(duì)顯性基因或顯性QTL位點(diǎn)控制。D1×LTH、D4-2×LTH和D38×LTH均能特異性擴(kuò)增目標(biāo)TAC克隆HPT目的基因條帶,抗感分離比符合9:7,但L4-1×LTH無(wú)理想的抗感分離比,表明D1×LTH、D4-2×LTH和D38×LTH抗病性可能被2對(duì)相補(bǔ)的基因控制。
【圖文】：

人工噴霧接種：排查孢子量多的培養(yǎng)皿，，加入雙蒸水，再將過濾好的孢子懸浮液，孢子濃度設(shè)置為 2×105/L，在顯微鏡下觀察，每個(gè)視野有 70～100 個(gè)孢子懸浮液，加入一滴吐溫 20，利用小型噴霧器均勻地噴灑在葉片上。接種完成后，將水稻盆轉(zhuǎn)移至大泡沫箱中，蓋上蓋子和遮光布，黑暗處理 24～36 小時(shí)，用透明膜蓋住泡沫箱，期間早、中、晚灑水以保持水稻葉片的濕度。2.2.6 孕穗期穗瘟人工注射接種方法人工注射接種：采用與苗期人工噴霧接種相同的方法一致。在水稻孕穗初期時(shí)，每穗注射 2ml 孢子懸浮液，待水稻成熟后調(diào)查病情。注：接種期間最佳溫度在 21-23C°，陰天接種好過晴天接種，傍晚接種好過白天接種。2.2.7 葉瘟的病害調(diào)查及統(tǒng)計(jì)人工噴霧接種葉瘟一周后便可調(diào)查并統(tǒng)計(jì)各個(gè)系列品種的發(fā)病情況，根據(jù)水稻葉面病斑的大小及性狀可將水稻的發(fā)病情況分為 6 個(gè)等級(jí)，具體標(biāo)準(zhǔn)參照Mackill and Bonman 報(bào)道[71]的鑒定方法（圖 1、表 2）進(jìn)行。

圖 2 部分 D 系列抗性基因 HPT 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 The results of pcr amplification part D series resistance gene HPT注：M：DL2000 DNAMarker；泳道 1：日本晴（下同）；泳道 2-24 分別為 D1、D3-1、D3-2、D4、D4-1、D4-2、D6、D11、D14、D19、D22、D22-2、D23、D24、D26、D30、D31、D32、D36、D38、D41、D42。Note: M：DL2000 DNAMarker; Lane 1: Oryza．Sativa L．spp．japonica，var Nipponbare，AA genom(The samebelow).圖 3 部分 D 系列抗性基因 SacB 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig. 3 The results of pcr amplification part D series resistance gene SacB注：M：DL2000 DNAMarker；泳道 1：日本晴；泳道 2-24 分別為 D1、D3-1、D3-2、D4、D4-1、D4-2、D6、D11、D14、D19、D22、D22-2、D23、D24、D26、D30、D31、D32、D36、D38、D41、D42。
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.111.41

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