發(fā)布時間：2020-05-11 21:08

【摘要】：近年來,我國馬鈴薯瘡痂病發(fā)生呈現嚴重趨勢,而長期化學農藥的使用不僅對環(huán)境及人類造成傷害,同時也會造成土壤菌群失調,導致瘡痂病害愈發(fā)嚴重。針對以上問題,本研究分離鑒定了一株對瘡痂鏈霉菌具有顯著抑制效果的生防菌株,并分析其活性蛋白性質,通過分離純化和質譜測序鑒定了活性蛋白。隨后對該菌株的最佳活性培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,并通過盆栽試驗和田間試驗對其實際防治效果進行了檢測,具體結果如下:從馬鈴薯瘡痂病發(fā)病嚴重區(qū)域收集土壤,利用稀釋涂布法、平板劃線法和管碟法分離篩選到了一株對瘡痂鏈霉菌具有明顯抑制作用的拮抗菌株,通過16S r DNA序列比對鑒定為芽孢桿菌,并命名為BU108。通過硫酸銨沉淀法提取菌液上清后發(fā)現蛋白質組分具有抗菌活性。對活性蛋白的穩(wěn)定性分析結果顯示:抗菌蛋白在溫度為100℃時加熱5 min后失去抗菌活性,在0.5 mg/m L胃蛋白酶及胰蛋白酶處理下失去抗菌活性,在p H中性條件下具有抗菌活性,對有機溶劑及金屬離子不敏感,對Tween-80較為敏感。使用陰離子交換柱對蛋白活性成分進行了分離和純化,對得到的三個蛋白條帶進行質譜測序,發(fā)現都屬于γ-谷氨酰轉肽酶(Gamma Glutamyl transpeptidase,GGT)的不同降解片段。經檢測,GGT全長蛋白的重組表達產物并不具備抗菌效果。而通過設計和合成抗菌肽發(fā)現降解后的片段則具有一定的抗菌活性,由此可以推斷GGT在培養(yǎng)過程中的降解產物對瘡痂鏈霉菌起到了抑制作用。采用單因素多水平試驗設計方法對菌株的抗菌活性進行了優(yōu)化,確定了單因素最佳水平。通過PB試驗確認碳源和氮源的質量比(C/N)、Na Cl含量和培養(yǎng)時間為最主要三個影響因素,隨后使用響應面分析法優(yōu)化確認C/N為1:2.5、Na Cl含量0.75%、培養(yǎng)時間23 h,為最佳培養(yǎng)條件。盆栽試驗設置BU108芽孢桿菌3組不同濃度的處理,分別為病原菌、BU108(低)、BU108(高),結果顯示,施用濃度為BU108(高)時效果最好,抑制率為90.00%,達到顯著性差異。田間試驗設置3組不同濃度的處理,分別為病原菌、BU108(低)、BU108(高),結果顯示,施用濃度為BU108(高)時,抑制率為88.57%,達到顯著性差異。由盆栽和田間試驗可知BU108芽孢桿菌能夠抑制馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生。本研究分離到一株防效顯著的芽孢桿菌,分析了菌株抗菌物質的穩(wěn)定性,明確了抗菌物質,進一步分析發(fā)現GGT的降解片段具有抗菌活性,確定了最佳培養(yǎng)條件,并經盆栽試驗及田間試驗驗證具有良好的防病效果。本研究不僅為馬鈴薯瘡痂病的生物防治提供了菌株材料,也為芽孢桿菌BU108的實際應用進行了探索并積累了經驗。
【圖文】：

篩選、鑒定續(xù) 8 年種植馬鈴薯的地塊采集馬鈴薯0 余株菌株，按排列順序依次命名為 對所有得到的菌株進行抗菌試驗，結果菌效果最為明顯（圖 3-1）。BU108 菌皺起；在液體培養(yǎng)基中色暗、皺褶、鏈霉菌有抗菌效果。過夜培養(yǎng)目的菌送交上海生工完成測序。在 16S rDN的菌株相似度最為接近的堿基序列，，系統(tǒng)進化樹。從進化樹中（圖 3-2）分is DV1-F-3(JH600273)親緣關系最近，

圖 3-2 BU108 的 16S rDNA 序列系統(tǒng)進化樹Fig.3-2 The phylogenetic tree of BU108 16S rDNA3.2 抗菌蛋白的性質分析3.2.1 抗菌蛋白粗提取BU108 菌株具有抑制瘡痂鏈霉菌活性，這種抗菌作用是否由菌株所產生的蛋白引起，為此設計了菌株蛋白粗提液抗菌試驗。培養(yǎng)拮抗菌，離心收集菌液上清，在上清液中加入硫酸銨至 80%，得到蛋白沉淀和菌液上清。分離到的蛋白沉淀分別加入涂有瘡痂鏈霉菌平板上的牛津杯中，蛋白組分有抗菌圈出現，CK(低鹽緩沖液)組分沒有抗菌圈出現（圖 3-3）�？咕γ黠@表明具有抗菌活性，說明菌株蛋白質組分有抗菌活性。
【學位授予單位】：黑龍江八一農墾大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S435.32;S476.1

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