【摘要】：由指狀青霉引起的綠霉病是柑橘采后最嚴(yán)重的真菌性病害之一。目前柑橘防治還是以化學(xué)防治為主,然而化學(xué)藥劑的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘毒量及抗藥病原菌的出現(xiàn)都迫使我們?nèi)ふ腋踩姆乐畏椒�。因此研究柑橘指狀青霉的致病機(jī)理,對其更好防控具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)指狀青霉轉(zhuǎn)化體系,建立擴(kuò)大轉(zhuǎn)化子突變體庫。對篩選出的不致病突變株P(guān)44-14-44,從生理水平分析其與野生菌株的表型差異,在分子水平上確定導(dǎo)致表型變化的突變基因,針對突變基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除,分析基因功能。主要研究結(jié)果如下:1、突變體庫的擴(kuò)建。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)指狀青霉轉(zhuǎn)化已獲得1000多個轉(zhuǎn)化子,能在潮霉素上穩(wěn)定生長,經(jīng)過隨機(jī)PCR驗(yàn)證均能擴(kuò)增出潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。2、比較突變株與野生株的生理水平差異。(1)對突變株與野生株分別進(jìn)行掃描和透射電鏡觀察。掃描電鏡下,觀察到野生株明顯的帚狀結(jié)構(gòu),突變株只有菌絲體,沒有帚狀結(jié)構(gòu)。透射電鏡下,野生株分生孢子細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞壁、隔膜、細(xì)胞膜及內(nèi)部的細(xì)胞器明顯,突變株細(xì)胞壁外圍明顯加黑加粗;(2)測量了接種突變株與野生株柑橘表面的p H。將無菌水、野生菌和突變菌孢子懸浮液分別接種到溫州蜜柑和紐荷爾臍橙,用平面p H計(jì)測量傷口表面p H,接種野生菌溫州蜜柑傷口處第三天p H從5.5下降到3.9,紐荷爾臍橙傷口p H從5.3下降到3.3,但是接種突變菌的和接種無菌水的結(jié)果保持一致,都沒有明顯的變化;(3)分析野生菌與突變菌的生長速率與孢子產(chǎn)量,培養(yǎng)第8 d時,野生菌菌苔的生長直徑是突變菌的5倍,第13 d時野生菌菌苔直徑是突變菌的近4倍,野生菌的孢子數(shù)量是突變菌的近7倍,發(fā)現(xiàn)突變菌的生長速率和孢子產(chǎn)量都明顯低于野生菌。3、突變株分子水平解析。(1)通過重測序技術(shù)確定了突變菌的T-DNA拷貝數(shù)與插入位點(diǎn),測序結(jié)果與之前的Southern blot和Tail-PCR結(jié)果保持一致。突變菌有3個T-DNA拷貝插入,有2個T-DNA插入導(dǎo)致兩個基因發(fā)生突變,分別命名為269、275基因,還有一個T-DNA插入位點(diǎn)位于兩個基因間隔區(qū);(2)針對兩個突變基因269、275,通過基因敲除的方法研究突變基因與指狀青霉致病性之間的關(guān)系。
【圖文】：

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1 試驗(yàn)材料2.1.1 試驗(yàn)菌株及質(zhì)粒N1 為本實(shí)驗(yàn)室分離保存的指狀青霉；P44 為意大利巴里大學(xué) Antonio Ippolito教授惠贈的指狀青霉菌株；P44-14-44 為本實(shí)驗(yàn)室篩選出來接種柑橘后完全不致病的指狀青霉突變株；用于轉(zhuǎn)化敲除的根瘤農(nóng)桿菌類型為 AGL-1；大腸桿菌感受態(tài) trans 5α（北京全式金），分別保存在-80℃冰箱中。轉(zhuǎn)化過程中所需的質(zhì)粒是 pTFCM, 其含有 T-DNA 插入臂序列，轉(zhuǎn)化過程中重要的抗性篩選標(biāo)記是潮霉素 B 抗性基因 hph，其由構(gòu)巢曲霉的強(qiáng)啟動子 PtrpC啟動和強(qiáng)終止子 TtrpC 終止�；蚯贸脑假|(zhì)粒為 pCAMBIA1300-HPH，以此構(gòu)建出 269、275 基因敲除質(zhì)粒 pCAMBIA1300-HPH-△269、pCAMBIA1300-HPH-△275。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位論文 結(jié)果與分析3.1 指狀青霉對潮霉素敏感性檢測在進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)之前，檢測野生指狀青霉對潮霉素抗生素的敏感性，確定篩選濃度。通過24孔板篩選，篩選濃度梯度分別為0、5、10、15、20和40 μg/m個濃度梯度 A-D 4 個試驗(yàn)重復(fù)，當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到 10 μg/mL 時，已經(jīng)完全了指狀青霉的生長，經(jīng)過多次試驗(yàn)重復(fù)，發(fā)現(xiàn) 10 μg/mL 的潮霉素均能抑制長，，結(jié)果穩(wěn)定。綜合考慮到后期轉(zhuǎn)化試驗(yàn)過程中既減少假陽性概率，又提效率，最終確定的轉(zhuǎn)化篩選濃度為 50 μg/mL。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.66

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2657351