【摘要】：自噬(autophagy)是一種保守的細胞內(nèi)物質(zhì)(蛋白質(zhì)、細胞器等)降解通路,在動物病毒和植物DNA病毒侵染過程中通常具有防御功能,與此同時,許多動物病毒也進化出一些逃避降解或者干擾自噬活性的反防御策略以利于病毒自身的侵染。植物RNA病毒是否也存在類似的干擾自噬的反防御策略目前尚不明確�；钚匝�(reactive oxygen species,ROS)的迸發(fā)通常會抑制病原物的入侵,但其與病毒侵染之間的關(guān)系尚不十分清楚。大麥條紋花葉病毒(Barleystripemosaicvirus,BSMV)是一種ss(+)RNA病毒,它編碼的γb蛋白在病毒侵染過程中有多種重要的功能。因此,本研究擬在確認Yb與寄主蛋白(ATG7和GOX)直接互作的基礎(chǔ)上,闡明γb蛋白通過抑制自噬途徑和活性氧迸發(fā)促進BSMV侵染的分子機制,明確γb蛋白的更多未知新功能。根據(jù)BSMV侵染的本生煙(Nicotiana benthamiana)中自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和自噬小泡的數(shù)量均顯著降低、而自噬流指示蛋白(NBR1)的積累量卻顯著上升等實驗結(jié)果,首次發(fā)現(xiàn)植物RNA病毒(BSMV)的侵染抑制了自噬的發(fā)生,γb蛋白是BSMV抑制自噬的關(guān)鍵因子,其抑制自噬和抑制RNA沉默的功能是相互獨立的。γb與自噬通路的關(guān)鍵蛋白ATG7在體內(nèi)和體外均可直接互作,其中γb蛋白的Y29是互作的關(guān)鍵氨基酸。通過體內(nèi)Co-IP、體外競爭性pull-down實驗和對ATG8/ATG8-PE的檢測,證明γb-ATG7的互作比ATG8-ATG7更強。因此,當(dāng)BSMV侵染時,γb競爭性地干擾了 ATG7和ATG8的相互作用并影響了 ATG8與PE分子的結(jié)合,γb是通過抑制自噬來促進BSMV的侵染。沉默ATG5和ATG7基因可增加BSMV的積累并加重癥狀、瞬時表達的ATG7蛋白抑制病毒侵染,這些結(jié)果證明自噬在BSMV的侵染過程中同樣具有抗病毒作用。不與ATG7互作的γbY29A突變體喪失了抑制自噬的功能,突變體病毒BSMVY29A的癥狀減弱、病毒積累量降低,表明在植物防御和病毒反防御的軍備競賽中ATG7是新發(fā)現(xiàn)的一個病原物效應(yīng)子的靶標(biāo)。利用DAB和NBT染色的方法分別對葉片中過氧化氫(H202)和超氧化物(O2-)進行檢測,首次發(fā)現(xiàn)BSMV侵染本生煙時抑制了 ROS的迸發(fā),通過瞬時表達BSMV不同蛋白,證明γb蛋白是抑制ROS的關(guān)鍵因子。利用雙分子熒光互補(BiFC)、免疫共沉淀(Co-IP)、GST pull-down和分子篩凝膠過濾等方法,證明過氧化物酶體乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GOX)與γb在體內(nèi)和體外直接互作。酶活檢測結(jié)果顯示,γb蛋白在體內(nèi)和體外均能抑制GOX的酶活,進而破壞了過氧化物酶體的氧化還原狀態(tài),抑制了過氧化物酶體中ROS的迸發(fā)。沉默GOX基因會導(dǎo)致寄主的ROS代謝發(fā)生紊亂,BSMV的侵染也會受到明顯的抑制。當(dāng)BSMV侵染時,γb蛋白通過與GOX的互作直接抑制GOX的酶活,調(diào)控過氧化物酶體中產(chǎn)生的ROS到適宜的水平,既促進病毒侵染又維持受侵染植株能正常生長。綜上所述,γb蛋白抑制細胞自噬和活性氧迸發(fā)以促進BSMV病毒侵染,該現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其分子機制的闡明,為深入理解病毒的侵染機制、及多功能γb蛋白在寄主防御和病毒反防御的博弈過程中的新功能提供了新的科學(xué)證據(jù)。
【圖文】：

根據(jù)發(fā)生過程和底物的差異，細胞自嗤0Ｊ以分為微自嗤（ｍｉｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ）、巨自嗤逡逑（ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ）以及分子伴侶蛋白介導(dǎo)的自唾（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ，邋ＣＡＭ）邋（Ｂａｓｓｈａｍ逡逑ｅｔａｌ．，邋２００６：Ｂ0ｙａｅｔａｌ．，２０ｎ）（圖１－１）。由液泡膜或者溶酶體膜直接內(nèi)陷形成小的泡狀結(jié)構(gòu)，將細逡逑胞內(nèi)的物質(zhì)降解即為微自噬（ＢａｓｓｈａｍｅｔａＬ邋２００６）；分子伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬同樣發(fā)生在液泡膜逡逑或者溶酶體膜上，但是這類蛋白的降解需要借助分子伴侶的作用將其轉(zhuǎn)運至液泡或溶酶體中，例逡逑如，具有類ＫＦＥＲＱ多肽結(jié)構(gòu)的蛋白可以被Ｈｓｐ７０蛋白識別，同時Ｈｓｐ７０可以與溶酶體膜蛋白逡逑ＬＡＭＰ－２Ａ蛋白相互作用，從而將帶有ＫＦＥＲＱ序列的蛋白運輸至溶酶體中發(fā)生降解（Ｂｏｙａ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１３）；巨自噬即通常提到的自噬

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文邐第一章文獻綜述逡逑（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ），可與邋ＡＴＧ９邋蛋白互作（Ｘｉｅ邋ａｎｄ邋Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，２００７；邋Ｙａｎｇ邋ａｎｄ邋Ｋｌｉｏｎｓｋｙ，逡逑２００９）。ＡＴＧｌ８邋可以與邋ＰＩ３Ｐ邋（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ邋３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）以及邋ＰＩ３Ｐ２邋（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ邋３，５－逡逑ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）互作，與ＰＩ３Ｐ的互作可以保護ＡＴＧ８－ＰＥ復(fù)合物使其免受ＡＴＧ４的錯誤剪切（Ｎａｉｒ逡逑ｅｔ邋ａｌ．，２０１０）。逡逑（ＩＩＩ）邋ＰＩ３Ｋ邋復(fù)合體（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－３－ｋｉｎａｓｅ，ＰｔｄＩｎｓ３Ｋ邋ｃｏｍｐｌｅｘ）。ＡＴＧ６／Ｂｅｃｌｉｎｌ邋和逡逑ＰＩ３Ｋ／ＶＰＳ３４復(fù)合體參與到自噬小體的成核過程（Ｈａｙｗａｒｄ邋ａｎｄ邋Ｄｉｎｅｓｈ－Ｋｕｍａｒ，２0ｌ邋ｌ）0逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S432.41

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 Russell L.Jones;;Hydrogen Sulfide Alleviates Aluminum Toxicity in Germinating Wheat Seedlings[J];Journal of Integrative Plant Biology;2010年06期

2 ;Hydrogen Sulfide Promotes Wheat Seed Germination and Alleviates Oxidative Damage against Copper Stress[J];Journal of Integrative Plant Biology;2008年12期

3 ;Arabidopsis AtBECLIN 1/AtAtg6/AtVps30 is essential for pollen germination and plant development[J];Cell Research;2007年03期

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本文編號：2657034