【摘要】：hrp基因是病原物與植物互作過程中,能夠在非寄主植物上引起過敏性發(fā)應(yīng),而在寄主植物致病的一類基因。hrp基因的編碼蛋白為Harpin,是一類富含甘氨酸、對熱穩(wěn)定、對蛋白酶K敏感的蛋白,它的一個重要功能是誘導(dǎo)激發(fā)植物體產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng),提高植物的抗病蟲和抗逆能力,并促進(jìn)植物生長、產(chǎn)量和品質(zhì)的提升。轉(zhuǎn)hrp基因的植物由于外源基因的整合可以大幅度的提高作物抗病蟲及其它逆境能力。植物應(yīng)對脅迫表現(xiàn)為一系列基因和基因產(chǎn)物的特異表達(dá)性,植物表達(dá)抗病反應(yīng)的過程也是抗病信號傳遞的過程。大豆(Glycine max)富含優(yōu)質(zhì)食用油脂、植物蛋白和對人體有益的多種生理活性物質(zhì),是世界上重要的油料作物、糧食作物、飼料作物、蔬菜作物和經(jīng)濟(jì)作物。大豆疫霉根腐病(Phytophthora sojae)是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一,在大豆生產(chǎn)上屬世界性病害,由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae M.J.Kauf-mannJ.W.Gerdemann)侵染引起。目前,防治該病最為有效的手段是選用抗病品種。但由于大豆疫霉菌毒力結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生理小種遺傳變異速度快,而常規(guī)育種技術(shù)周期長,工作量較大,缺乏抗性資源,難以滿足生產(chǎn)的需要。隨著hrp基因作用機(jī)制的深入研究以及植物基因工程技術(shù)的逐漸成熟,利用抗病基因工程育種成為解決大豆抗疫霉根腐病難題的有效途徑之一。hrpZpsta基因來源于煙草野火病病原菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)Psta218菌株,是hrp基因家族中的一員。本研究以常用的大豆模式材料(Jack,Williams 82)及大豆生產(chǎn)品種沈農(nóng)9號、華春6號等作為轉(zhuǎn)基因受體。為確保hrpZpsta基因在受體中的正常表達(dá),根據(jù)大豆基因組密碼子的偏好性,將hrpZpsta基因優(yōu)化并命名為hrpZm。以hrpZm為目標(biāo)基因,以草丁膦作為篩選標(biāo)記構(gòu)建表達(dá)載體,采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將hrpZm基因轉(zhuǎn)入到受體品種中。通過對連續(xù)多代的轉(zhuǎn)基因后代材料抗大豆疫霉根腐病的生物學(xué)功能鑒定、HrpZm蛋白功能解析和遺傳穩(wěn)定性篩選,獲得對大豆疫霉根腐病具有較高抗性的新種質(zhì)材料HP116。以HP116及對應(yīng)受體為實(shí)驗(yàn)材料,對其抗病反應(yīng)、抗病基因表達(dá)及抗病生理活性物質(zhì)合成量進(jìn)行比較研究,為研究hrpZm基因通過激發(fā)多條抗病信號途徑提高植物抗病性的作用機(jī)理提供了新的證據(jù)。本研究主要結(jié)果如下:1、本研究根據(jù)大豆密碼子偏愛性,將hrpZpsta基因進(jìn)行人工優(yōu)化合成,優(yōu)化后的hrpZm基因長度為423bp,與原基因序列有73.52%的相似度,GC含量為47.8%,構(gòu)建到植物表達(dá)載體pTF101-Gmubi3中,構(gòu)建了植物重組表達(dá)載體pTF101-Gmubi3-hrpZm。2、將重組表達(dá)載體pTF101-Gmubi3-hrpZm轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA101中。以大豆的子葉節(jié)為外植體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆,將目的基因hrpZm導(dǎo)入到受體材料中。本研究中,受體Jack、Williams82、華春6號、沈農(nóng)9號的轉(zhuǎn)化率分別為5.06%,4.24%,1.24%,1.82%,遺傳轉(zhuǎn)化的平均轉(zhuǎn)化率為2.48%。共獲得再生苗679株,其中受體為Jack的147株,受體為華春6號的的192株,受體為Williams 82的134株,受體為沈農(nóng)9號的206株。3、種植T_0代收獲的種子于溫室中,單株采用與T_0代相同的鑒定方法,同一株系的種子混合收獲,T_1代入選轉(zhuǎn)基因群體27個。從T_2代開始,對來自于不同轉(zhuǎn)基因事件的連續(xù)多代的轉(zhuǎn)基因后代群體進(jìn)行抗大豆疫霉根腐病的生物學(xué)功能鑒定,解析了HrpZm的生物學(xué)功能。在不同世代中綜合考量PCR檢測,Southern雜交,RT-PCR檢測,Western雜交分析,ELISA分析及Real time-PCR等多項檢測分析的結(jié)果,篩選到來自于轉(zhuǎn)基因事件B4J9116的后代株系B4J9116-6-2-4,該株系T_2-T_3代的多個單株Southern雜交檢測結(jié)果均顯示單一條帶,T_3-T_5代PCR檢測陽性率均為100%,T_3代RT-PCR檢測和Western雜交結(jié)果均顯示陽性,T_3代葉片中基因表達(dá)量、T_4代不同采樣部位基因表達(dá)量的Real time-PCR檢測分析目標(biāo)基因均表現(xiàn)出較高的基因表達(dá)量,T_4代單株靶標(biāo)蛋白ELISA特異性測定HrpZm和PAT蛋白均表現(xiàn)出了較高的檢出率,T_5代對大豆疫霉根腐病的抗性,出苗,結(jié)實(shí)等性狀均表現(xiàn)優(yōu)異,田間種植農(nóng)藝性狀與受體無明顯差異,將株系定名為HP116。4、以HP116為實(shí)驗(yàn)材料,采用Real time-PCR技術(shù)測定了R基因抗性、細(xì)胞程序性死亡、水楊酸、茉莉酸等多條信號途徑關(guān)鍵基因表達(dá)量,其中水楊酸信號途徑關(guān)鍵基因PR1、PR12、PAL在大豆疫霉根腐病為害的大豆植株的葉片上基因表達(dá)量均表現(xiàn)出明顯的上調(diào)。茉莉酸信號途徑基因AOS基因表達(dá)量在葉片上微弱上調(diào),而PPO卻明顯的上調(diào)。細(xì)胞程序性死亡GmNPR1和GmNPR2明顯上調(diào),而與R基因抗性相關(guān)的基因GmSGT1基因表達(dá)量微弱上調(diào),RAR基因表達(dá)量明顯的上調(diào)。基因的相對表達(dá)量檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)hrpZm基因大豆株系中對大豆疫霉根腐病的抗性是多種調(diào)控機(jī)制共同作用的結(jié)果,多條抗病途徑的協(xié)同交互作用實(shí)現(xiàn)了該過程。轉(zhuǎn)基因種質(zhì)HP116由于外源基因的導(dǎo)入其對病原菌的傷害與受體相比表現(xiàn)出了不同的防御機(jī)制。在抵抗大豆疫霉根腐病的侵染時RAR、GmSTG1、GmNPR1、GmNPR2、PAL、PR1、PR12、PPO等基因均起到了重要的作用。5、在病原菌侵染前,HP116幼苗葉片中各防御酶的活性除PAL外均較受體高,在被大豆疫霉根腐病病原菌侵染的過程中,PAL、POD、PPO及SOD酶活性均呈上升的趨勢,其中PAL、PPO兩種酶活性迅速升高,同時啟動水楊酸信號途徑和茉莉酸信號途徑,兩個途徑協(xié)同作用抵抗病原菌的入侵。雖然不同的酶變化趨勢及峰值出現(xiàn)的時間和頻率略有不同,但活性顯著高于受體,表明hrpZm基因在受體基因組中的整合提高了受體品種的抗病性和對病原菌侵染的反應(yīng)、抵抗能力。本研究利用優(yōu)化后的hrpZm基因轉(zhuǎn)化獲得對大豆疫霉根腐病抗性升高的轉(zhuǎn)基因新種質(zhì)。hrpZm基因在受體基因組中的整合影響和調(diào)控了受體原有的抗病代謝途徑,激活了R基因抗性、細(xì)胞程序性死亡、水楊酸、茉莉酸等多條信號途徑,使得大豆抗病性性狀得到改良,為大豆抗疫霉根腐病育種奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

. 1 2006-2017 全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積變化趨勢（igure 1.1 Worldwide production of trangenic crop from 2006 ps://www.qianzhan.com/analyst/detail/220/180913-27ef70際貿(mào)易的全球化，目前我國的大豆產(chǎn)業(yè)已經(jīng)完全市場大大豆生產(chǎn)國，但同時也是世界上最大的大豆進(jìn)口國我國的大豆完全自給，曾是一個凈出口國。1996 年

2.4 結(jié)果與分析2.4.1 hrpZpsta 基因的優(yōu)化大豆多聚泛肽啟動子在大豆中具有較強(qiáng)的啟動效率[179]，根據(jù)大豆密碼子愛性，將來源于煙草野火病病原菌 P.syringae pv. tabaci Psta218的hrpZpsta 基進(jìn)行人工優(yōu)化合成并命名為 hrpZm。hrpZm 基因與 hrpZpsta 基因比對結(jié)果如2.1所示。優(yōu)化后的 hrpZm 基因兩端分別添加 XbaI/SacI 雙酶切位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)期驗(yàn)證的 XbaI/SacI 雙酶切。hrpZm 基因長度為423 bp，與原序列相似度73.52%，GC含量為47.8%。分別將hrpZm基因與hrpZpsta基因進(jìn)行氨基酸序列譯，并對翻譯后的氨基酸序列進(jìn)行比對，，如圖2.2所示，有7個氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變。本研究未對改造后基因翻譯得到的氨基酸序列進(jìn)行深入的分析，不明確折疊后是否會發(fā)生空間結(jié)構(gòu)和功能的改變或喪失。改造后的hrpZm基因在穩(wěn)定入大豆后能否行使預(yù)想的蛋白質(zhì)功能，通過后期的生物學(xué)功能鑒定予以證明。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.651

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2648320