【摘要】：蛋白酶抑制劑是一類廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)的小分子多肽或者蛋白質(zhì),抑制蛋白水解酶的催化活性。本研究通過苜蓿接蚜差異基因組學(xué)分析,得到了不同抗性苜蓿品種差異表達的苜蓿胰蛋白酶抑制劑基因,采用基因工程等技術(shù)手段,克隆了該基因全長序列,構(gòu)建了高效重組表達載體并進行了重組蛋白的純化,利用人工飼料摻入法測定了苜蓿胰蛋白酶抑制劑對苜蓿斑蚜蟲生長和發(fā)育的影響,研究了對苜蓿斑蚜體內(nèi)主要蛋白酶活性的抑制作用,結(jié)果表明重組蛋白對苜蓿斑蚜具有很好的抑制作用,明顯的抑制了苜蓿斑蚜體內(nèi)蛋白酶的活性并導(dǎo)致死亡。本研究取得了如下研究結(jié)論:進行了苜蓿接蚜轉(zhuǎn)錄組測序分析,篩選到了差異表達的6個苜蓿胰蛋白酶抑制劑基因,實時熒光定量PCR驗證后,NCBI比對,設(shè)計了兩條寡核苷酸引物,以苜蓿葉總基因組c DNA為模板,進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增得到長度約為657 bp和612 bp的大小的兩個Kunnitz型胰蛋白酶抑制基因,篩選出陽性轉(zhuǎn)化子,菌液PCR驗證該基因片段為所需目的基因全長片段,命名Msti-95(Medicago sativa trypsin inhibitor 95)和Msti-16(Medicago sativa trypsin inhibitor 16)。設(shè)計合成兩條5’端含有限制性內(nèi)切酶Bam HI和3’端含有Xho I酶切位點的寡核苷酸引物,進行PCR擴增獲得目的片段,大腸桿菌轉(zhuǎn)化后得到重組質(zhì)粒p T-Msti-95和p T-Msti-16,將獲得的目的片段和原核表達載體p SYno-1同時采用Bam HI和Xho I雙酶切,接下來利用T4 DNA連接酶構(gòu)建表達載體,提取陽性菌落質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切鑒定和測序分析確定Msti-95和Msti-16基因均已成功插入到表達載體中,構(gòu)建重組表達載體p S-Msti-95和p S-Msti-16。IPTG誘導(dǎo),獲取最佳表達條件,使目的基因獲得高效的表達;SDS-PAGE電泳檢測,結(jié)果表明目的基因有高效表達,接下來采用鎳(Ni-NTA)柱,以含有咪唑的Wash buffer上樣,洗脫,經(jīng)蛋白電泳檢測后獲得純度較高的表達蛋白。采用飼喂法測定了蛋白抑制劑Msti-95和Msti-16表達純化蛋白對苜蓿斑蚜存活、繁殖的影響。結(jié)果表明,純化蛋白具胃毒活性,抑制苜蓿斑蚜生長發(fā)育。苜蓿斑蚜取食含濃度為800μg/m L的Msti-95和Msti-16表達純化蛋白混合純?nèi)斯わ暳系拇婊盥史謩e為21.7%(P=0.04)和18.3%(P=0.03),兩者均顯著低于對照組60.0%的存活率;繁殖率分別為186.7%(P=0.04)和198.3%(P=0.05),兩者均顯著性低于對照組315.0%的繁殖率。Elisa酶聯(lián)免疫吸附測定了對蟲體內(nèi)蛋白酶活性的影響,結(jié)果表明取食含濃度為800μg/m L的純化蛋白混合純?nèi)斯わ暳系能俎０哐梁?苜蓿斑蚜體內(nèi)總蛋白酶較對照組酶活性均顯著降低(P0.05);苜蓿胰蛋白酶重組表達菌體處理濃度為5000μg/m L以上處理組苜蓿斑蚜,總蛋白酶(Pr)、氨肽(APs)酶、胰蛋白酶(Tr)、胰凝乳蛋白酶(CTP)的活性顯著降低(P0.05)。
【圖文】：

植物本身具有的莖、葉、絨毛、蠟質(zhì)、細胞壁組成等（Paiva et al., 2000）。后是形成了誘導(dǎo)型防御機制，是由于外界刺激后引起的連鎖反應(yīng)，誘導(dǎo)型防御一般來說是具有起著主導(dǎo)作用的地位（Maleck et al., 1999）。如圖1.1（引自Zust T & Agrawal A A. Natureplants,2016, doi: 1038/NPLANTS. 2015. 206）所示，以蚜蟲為代表性的刺吸式口器昆蟲取食植物汁液與植物啟動防御反應(yīng)示意圖。圖 1. 1 蚜蟲取食與植物防御反應(yīng)示意圖1：蚜蟲刺吸式口器刺透植物體壁；2：分泌唾液包裹口針；3：口針在韌皮部吸食汁液或分泌唾液包裹效應(yīng)子蛋白；4：被破壞的植物韌皮部開始愈合；5：植物體合成防御次級代謝產(chǎn)物；6：次級代謝產(chǎn)物在韌皮部運輸；7：次級代謝產(chǎn)物在蚜蟲腸道或血淋巴中被消化和吸收；8：次級代謝產(chǎn)物在血淋巴中積累或通過后腸被排出體外；9：次級代謝產(chǎn)物被消解并隨蚜蟲蜜露排除體內(nèi)。Fig. 1.1 A schematic of aphid feeding and plant responses.1: Piercing the wall of plants by aphid spiny mouthparts; 2: Package needle by secreting salivary; 3: The mouth needlesucks juice or secretes saliva effector protein in phloem; 4: The damaged phloem begins to heal; 5: Plant synthetic thesecondary metabolites; 6: Secondary metabolites transport in phloemare; 7: Secondary metabolites are digested and absorbedin the intestinal tract or hemolymph of aphids; 8: Secondary metabolites are accumulated in the hemolymph or excretedthrough the hindgut; 9: Secondary metabolites were eliminated and eliminated with aphid honeydew.1.3.2 苜蓿蟲害與苜蓿斑蚜的防治研究紫花苜蓿（Medicago sativa），豆科植物（Leguminosae）

L CHCl3萃取，振蕩均勻，，室in；換離心管，滴入等倍體積的in；in，棄濾液；水 C H O，12000 r/min 高速離2~3 min；加入50 μL 65℃預(yù)熱的無核酸NA；；物電泳檢測再次確認提取質(zhì)庫構(gòu)建，主要流程有總RNA段選擇和PCR富集，文庫質(zhì)量
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ453

【參考文獻】

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本文編號：2648266