【摘要】：蛋白酶抑制劑是一類廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)的小分子多肽或者蛋白質(zhì),抑制蛋白水解酶的催化活性。本研究通過(guò)苜蓿接蚜差異基因組學(xué)分析,得到了不同抗性苜蓿品種差異表達(dá)的苜蓿胰蛋白酶抑制劑基因,采用基因工程等技術(shù)手段,克隆了該基因全長(zhǎng)序列,構(gòu)建了高效重組表達(dá)載體并進(jìn)行了重組蛋白的純化,利用人工飼料摻入法測(cè)定了苜蓿胰蛋白酶抑制劑對(duì)苜蓿斑蚜蟲生長(zhǎng)和發(fā)育的影響,研究了對(duì)苜蓿斑蚜體內(nèi)主要蛋白酶活性的抑制作用,結(jié)果表明重組蛋白對(duì)苜蓿斑蚜具有很好的抑制作用,明顯的抑制了苜蓿斑蚜體內(nèi)蛋白酶的活性并導(dǎo)致死亡。本研究取得了如下研究結(jié)論:進(jìn)行了苜蓿接蚜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,篩選到了差異表達(dá)的6個(gè)苜蓿胰蛋白酶抑制劑基因,實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證后,NCBI比對(duì),設(shè)計(jì)了兩條寡核苷酸引物,以苜蓿葉總基因組c DNA為模板,進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得到長(zhǎng)度約為657 bp和612 bp的大小的兩個(gè)Kunnitz型胰蛋白酶抑制基因,篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,菌液PCR驗(yàn)證該基因片段為所需目的基因全長(zhǎng)片段,命名Msti-95(Medicago sativa trypsin inhibitor 95)和Msti-16(Medicago sativa trypsin inhibitor 16)。設(shè)計(jì)合成兩條5’端含有限制性內(nèi)切酶Bam HI和3’端含有Xho I酶切位點(diǎn)的寡核苷酸引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的片段,大腸桿菌轉(zhuǎn)化后得到重組質(zhì)粒p T-Msti-95和p T-Msti-16,將獲得的目的片段和原核表達(dá)載體p SYno-1同時(shí)采用Bam HI和Xho I雙酶切,接下來(lái)利用T4 DNA連接酶構(gòu)建表達(dá)載體,提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序分析確定Msti-95和Msti-16基因均已成功插入到表達(dá)載體中,構(gòu)建重組表達(dá)載體p S-Msti-95和p S-Msti-16。IPTG誘導(dǎo),獲取最佳表達(dá)條件,使目的基因獲得高效的表達(dá);SDS-PAGE電泳檢測(cè),結(jié)果表明目的基因有高效表達(dá),接下來(lái)采用鎳(Ni-NTA)柱,以含有咪唑的Wash buffer上樣,洗脫,經(jīng)蛋白電泳檢測(cè)后獲得純度較高的表達(dá)蛋白。采用飼喂法測(cè)定了蛋白抑制劑Msti-95和Msti-16表達(dá)純化蛋白對(duì)苜蓿斑蚜存活、繁殖的影響。結(jié)果表明,純化蛋白具胃毒活性,抑制苜蓿斑蚜生長(zhǎng)發(fā)育。苜蓿斑蚜取食含濃度為800μg/m L的Msti-95和Msti-16表達(dá)純化蛋白混合純?nèi)斯わ暳系拇婊盥史謩e為21.7%(P=0.04)和18.3%(P=0.03),兩者均顯著低于對(duì)照組60.0%的存活率;繁殖率分別為186.7%(P=0.04)和198.3%(P=0.05),兩者均顯著性低于對(duì)照組315.0%的繁殖率。Elisa酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定了對(duì)蟲體內(nèi)蛋白酶活性的影響,結(jié)果表明取食含濃度為800μg/m L的純化蛋白混合純?nèi)斯わ暳系能俎０哐梁?苜蓿斑蚜體內(nèi)總蛋白酶較對(duì)照組酶活性均顯著降低(P0.05);苜蓿胰蛋白酶重組表達(dá)菌體處理濃度為5000μg/m L以上處理組苜蓿斑蚜,總蛋白酶(Pr)、氨肽(APs)酶、胰蛋白酶(Tr)、胰凝乳蛋白酶(CTP)的活性顯著降低(P0.05)。
【圖文】：

植物本身具有的莖、葉、絨毛、蠟質(zhì)、細(xì)胞壁組成等（Paiva et al., 2000）。后是形成了誘導(dǎo)型防御機(jī)制，是由于外界刺激后引起的連鎖反應(yīng)，誘導(dǎo)型防御一般來(lái)說(shuō)是具有起著主導(dǎo)作用的地位（Maleck et al., 1999）。如圖1.1（引自Zust T & Agrawal A A. Natureplants,2016, doi: 1038/NPLANTS. 2015. 206）所示，以蚜蟲為代表性的刺吸式口器昆蟲取食植物汁液與植物啟動(dòng)防御反應(yīng)示意圖。圖 1. 1 蚜蟲取食與植物防御反應(yīng)示意圖1：蚜蟲刺吸式口器刺透植物體壁；2：分泌唾液包裹口針；3：口針在韌皮部吸食汁液或分泌唾液包裹效應(yīng)子蛋白；4：被破壞的植物韌皮部開始愈合；5：植物體合成防御次級(jí)代謝產(chǎn)物；6：次級(jí)代謝產(chǎn)物在韌皮部運(yùn)輸；7：次級(jí)代謝產(chǎn)物在蚜蟲腸道或血淋巴中被消化和吸收；8：次級(jí)代謝產(chǎn)物在血淋巴中積累或通過(guò)后腸被排出體外；9：次級(jí)代謝產(chǎn)物被消解并隨蚜蟲蜜露排除體內(nèi)。Fig. 1.1 A schematic of aphid feeding and plant responses.1: Piercing the wall of plants by aphid spiny mouthparts; 2: Package needle by secreting salivary; 3: The mouth needlesucks juice or secretes saliva effector protein in phloem; 4: The damaged phloem begins to heal; 5: Plant synthetic thesecondary metabolites; 6: Secondary metabolites transport in phloemare; 7: Secondary metabolites are digested and absorbedin the intestinal tract or hemolymph of aphids; 8: Secondary metabolites are accumulated in the hemolymph or excretedthrough the hindgut; 9: Secondary metabolites were eliminated and eliminated with aphid honeydew.1.3.2 苜蓿蟲害與苜蓿斑蚜的防治研究紫花苜蓿（Medicago sativa），豆科植物（Leguminosae）

L CHCl3萃取，振蕩均勻，，室in；換離心管，滴入等倍體積的in；in，棄濾液；水 C H O，12000 r/min 高速離2~3 min；加入50 μL 65℃預(yù)熱的無(wú)核酸NA；；物電泳檢測(cè)再次確認(rèn)提取質(zhì)庫(kù)構(gòu)建，主要流程有總RNA段選擇和PCR富集，文庫(kù)質(zhì)量
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ453

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳志剛;朱蒙猛;張蓉;張澤華;李志紅;;苜蓿斑蚜對(duì)我國(guó)苜蓿商品草的經(jīng)濟(jì)損失評(píng)估[J];寧夏農(nóng)林科技;2013年11期

2 唐平華;陳國(guó)平;朱明庫(kù);任麗軍;胡宗利;;蚜蟲防治技術(shù)研究進(jìn)展[J];植物保護(hù);2013年02期

3 徐林波;;苜蓿斑蚜實(shí)驗(yàn)種群生命表研究[J];中國(guó)植保導(dǎo)刊;2013年03期

4 高文興;王孟卿;陳紅印;;蚜蟲人工飼料的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J];中國(guó)生物防治學(xué)報(bào);2012年01期

5 朱猛蒙;孫玉榮;張蓉;于釗;黃文廣;;基于GIS的苜蓿斑蚜區(qū)域化預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)技術(shù)初步研究[J];草業(yè)學(xué)報(bào);2011年02期

6 郭榮;;我國(guó)生物農(nóng)藥的推廣應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展策略[J];中國(guó)生物防治學(xué)報(bào);2011年01期

7 劉長(zhǎng)仲;蘭金娜;;苜蓿斑蚜對(duì)三個(gè)苜蓿品種幼苗氧化酶的影響[J];草地學(xué)報(bào);2009年01期

8 馬建華;朱猛蒙;張蓉;于海洋;馬銳;;苜蓿斑蚜的生物藥劑篩選試驗(yàn)及對(duì)其天敵的安全性[J];農(nóng)藥;2008年08期

9 邱德文;;我國(guó)生物農(nóng)藥現(xiàn)狀分析與發(fā)展趨勢(shì)[J];植物保護(hù);2007年05期

10 劉裕強(qiáng);江玲;孫立宏;王春明;翟虎渠;萬(wàn)建民;;褐飛虱刺吸誘導(dǎo)的水稻一些防御性酶活性的變化[J];植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào);2005年06期

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1 黃偉;不同紫花苜蓿品種抗蚜性鑒定及抗性機(jī)理初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2648266