【摘要】：馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus),是最大植物RNA病毒種類之一,可侵染馬鈴薯、番茄、辣椒、煙草等多種經(jīng)濟(jì)作物,給農(nóng)作物造成產(chǎn)量損失。基于PVY與馬鈴薯抗性基因的識(shí)別關(guān)系可區(qū)分為:PVY~O、PVY~C、PVY~Z、PVY~N、PVY~E,其中PVY~N可引起煙草葉脈壞死。根據(jù)PVY基因組內(nèi)是否存在重組分為非重組型和重組型分離物。近期新發(fā)現(xiàn)的PVY分離物大都屬于重組型,暗示PVY種群由最初的PVY~O、PVY~N等非重組型分離物轉(zhuǎn)變?yōu)橹亟M型分離物。本研究對(duì)貴州省煙草主產(chǎn)區(qū)疑似病毒病侵染的樣品進(jìn)行血清學(xué)、生物學(xué)及分子生物學(xué)分析,初步了解侵染貴州省煙草的主要病毒種群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)PVY重組株系PVY~(NTN-NW)成為田間發(fā)病的優(yōu)勢(shì)株系。通過(guò)分析不同嵌合體病毒移動(dòng)和積累水平變化及在不同寄主上侵染性,明確了影響PVY的致病性的相關(guān)區(qū)域。具體結(jié)果如下:(1)鑒定了危害貴州省煙草的病毒種類。利用小RNA高通量測(cè)序技術(shù),分析貴州省煙草樣品混樣中病毒的種類,結(jié)果發(fā)現(xiàn)危害貴州省煙草的病毒種類有煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、黃瓜花葉病毒(CMV)、野生番茄花葉病毒(WTMV)、辣椒環(huán)斑病毒(ChiRSV)5種,其中尤以PVY、TVBMV危害嚴(yán)重。(2)分析危害貴州煙草PVY分離物的株系情況。利用血清學(xué)方法對(duì)貴州煙草主產(chǎn)區(qū)采集的35個(gè)疑似病毒病樣品進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PVY檢出率為57.1%。將PVY陽(yáng)性樣品接種普通煙,發(fā)現(xiàn)6個(gè)分離物僅表現(xiàn)花葉癥狀,14個(gè)分離物表現(xiàn)壞死和花葉癥狀�；赑1/HCpro編碼序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),本研究獲得的20個(gè)分離物中,6個(gè)分離物與N株系代表性分離物N-605|X97895聚集在P1HC-II組,6個(gè)分離物與O株系代表性分離物O-139|U09509共同聚集在P1HC-III組,其余8個(gè)分離物與SYR-II-2-8|AB461451等重組型分離物聚集在一組;基于CP編碼序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),本研究獲得的全部分離物與ShX14|KJ634024、O_Z|EF026074等分離物聚集在一起。重組分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)分離物在P1編碼區(qū)域存在重組事件。結(jié)合PVY基因組結(jié)構(gòu)分析,明確危害貴州省煙草的PVY主要包含重組株系PVY~(NTN-NW)及非重組株系PVY~O,且重組株系PVY~(NTN-NW)為田間發(fā)病的優(yōu)勢(shì)株系。(3)PVY基因組的2480 nt-5852 nt參與癥狀形成和病毒積累。通過(guò)分段擴(kuò)增和同源重組的方法,將侵染性克隆PVY~N605、分離物PVY~O和PVY~(SYRII)相應(yīng)基因組替換pCamPVY~(SYRI)-GFP侵染性克隆相應(yīng)區(qū)域,獲得嵌合體PVY-A(NONN)、pCamPVY~(SYRII)-GFP、PVY-B(NOOO)和PVY-C(NNNO)。接種上述嵌合體到本氏煙,發(fā)現(xiàn)PVY-C(NNNO)與PVY~N605-GFP發(fā)病癥狀嚴(yán)重程度相似,二者的病毒積累水平相似且顯著高于其它嵌合體。分析嵌合體基因組結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)癥狀發(fā)現(xiàn),PVY基因組2480nt-5852nt序列(編碼P3中間區(qū)域及C端區(qū)域、6K1、CI、6K2、VPg N端區(qū)域的蛋白)與癥狀嚴(yán)重程度和病毒積累水平有關(guān)。接種后第七天PVY~(SYRII)-GFP在系統(tǒng)葉片積累水平提高,顯著高于PVY-A(NONN)和PVY~(SYRI)-GFP。比較pCamPVY~(SYRII)-GFP與pCamPVY~(SYRI)-GFP序列差異僅存在于5’UTR、P1、HCpro、P3的N端,表明該區(qū)域序列具有增強(qiáng)病毒積累水平的能力。(4)PVY基因組2480nt-5852nt是決定PVY侵染辣椒的關(guān)鍵區(qū)域。將含有PVY不同嵌合體的本氏煙系統(tǒng)發(fā)病葉片,通過(guò)機(jī)械摩擦接種馬鈴薯品種Shepody、Favorita和Desiree,發(fā)現(xiàn)上述PVY嵌合體均能系統(tǒng)侵染馬鈴薯。同樣通過(guò)機(jī)械摩擦接種辣椒品種特大牛角王和臺(tái)灣特大948牛角,發(fā)現(xiàn)PVY~(SYRI)-GFP、PVY-A(NONN)、PVY~(SYRII-)GFP能夠系統(tǒng)侵染,而PVY~N605-GFP、PVY-C(NNNO)不能系統(tǒng)侵染辣椒。比較PVY不同嵌合體的基因組結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)PVY基因組2480nt-5852nt(編碼P3中間區(qū)域及C端區(qū)域、6K1、CI、6K2、VPg N端的蛋白)是決定PVY能否系統(tǒng)侵染辣椒的關(guān)鍵區(qū)域。(5)PVY基因組5’端編碼區(qū)與病毒移動(dòng)、積累有關(guān)。PVY~(SYRI)型分離物CN:GZ23:16和pCamPVY~(SYRI)-GFP侵染性克隆在基因組的5’端序列上存在差異,將CN:GZ23:16分離物的5’端序列(5’UTR、P1、HCpro、P3的N端)替換pCamPVY~(SYRI)-GFP侵染性克隆中相應(yīng)區(qū)域,獲得嵌合體pCamPVY~(SYRI-5N)-GFP。將上述分離物接種本氏煙,發(fā)現(xiàn)二者在浸潤(rùn)葉片熒光強(qiáng)度、病毒積累水平、病毒移動(dòng)速度均低于PVY~N605-GFP。嵌合體PVY~(SYRI-5N)-GFP在病毒細(xì)胞間移動(dòng)、系統(tǒng)移動(dòng)速度快于PVY~(SYRI)-GFP,且表現(xiàn)明顯矮化癥狀,表明PVY基因組5’端編碼區(qū)參與病毒移動(dòng)、積累及癥狀形成。
【圖文】：

-2FD、SW-CJ-1BU 蘇凈安泰碼照相機(jī)（80D，Canon）、體式、振蕩儀（QL-901Vortex 海門、蛋白核酸定量測(cè)定儀（瑞典恒科學(xué)儀器）、電子天平（MEt）、超純水機(jī)（Simplicity U似樣品，通過(guò) TransZolUp 方法通過(guò) RT-PCR 擴(kuò)增及 PAGE 膠備后續(xù)測(cè)序分析（圖 2-1）。

圖 2-2 生物信息分析流程Fig. 2-2 Biological information analysis process煙草樣品中 PVY 檢測(cè)及其生物學(xué)性狀VY 抗血清通過(guò)間接 ELISA 方法對(duì)貴州采集的病毒病疑似樣品進(jìn)5 侵染的普通煙作為陽(yáng)性對(duì)照，健康普通煙為陰性對(duì)照。在陽(yáng)性 時(shí)讀數(shù)，樣品 Abs405值為陰性對(duì)照兩倍時(shí)判定樣品為 PVY 為陽(yáng)Y 血清學(xué)陽(yáng)性煙草樣品分別置于磨樣袋中，按照 1：5（質(zhì)量體積磨，通過(guò)汁液摩擦接種至 4-6 周普通煙 NC89。選取普通煙完全金剛砂，用無(wú)針頭注射器吸取研磨液置于待接種葉片，，摩擦接種干凈，對(duì)照組用超純水摩擦接種。定期觀察接種后普通煙癥狀。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S432.41

【參考文獻(xiàn)】

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1 汪沛;湯琳菲;雷艷;熊興耀;聶先舟;胡新喜;;辣椒病毒病研究進(jìn)展[J];湖南農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年07期

2 高芳鑾;常飛;沈建國(guó);謝聯(lián)輝;詹家綏;;PVY~(NTN-NW)榆林分離物的全基因組序列測(cè)定與分析[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年02期

3 李河;周國(guó)英;徐建平;朱丹雪;;一種油茶新炭疽病原的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定[J];植物保護(hù)學(xué)報(bào);2014年05期

4 劉洪義;梁五生;劉忠梅;張洪祥;楊立群;;黑龍江省部分地區(qū)馬鈴薯Y病毒株系檢測(cè)[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年01期

5 賈廣成;周增強(qiáng);侯琿;王麗;朱建蘭;;蘋果輪紋病菌的多基因聯(lián)合鑒定[J];生物技術(shù)通報(bào);2013年07期

6 鄧寬平;丁海兵;雷尊國(guó);;實(shí)時(shí)定量PCR鑒定貴州馬鈴薯Y病毒的主要株系[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年12期

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8 郭小建;;馬鈴薯Y病毒廣東分離物HC-Pro基因的克隆和序列分析[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年20期

9 陳士華;劉曉磊;張曉婷;吳興泉;;中國(guó)部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)馬鈴薯Y病毒(PVY)的株系分化與鑒定[J];河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2011年05期

10 楊慶東;吳興泉;陳士華;劉曉磊;;PVY株系間的分子變異及分子鑒定方法[J];中國(guó)馬鈴薯;2011年03期

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本文編號(hào)：2646356